Ипритка растение: ядовитое растение на Курилах. ПоискПути

В правительственной директиве с изложением программы, которая доступна только на вьетнамском языке, отмечается, что посевы будут сосредоточены в городских районах, промышленных зонах, зонах экспортной обработки и транспортных коридорах, но не указывает, почему. Он начинается с упоминания воздействия изменения климата и экстремальных погодных явлений на жизнь людей и имущество и называет «радикальное освоение лесов» «неотложной задачей и долгосрочной стратегической задачей».

Безусловно, нехватка зеленых насаждений — хроническая проблема городских районов Вьетнама.Например, правительство Хошимина, коммерческого центра страны, заявляет, что в городе на одного жителя приходится всего 0,55 кв. М (6 кв. Футов) общественного парка, по сравнению с 30 кв. М (326 кв. Футов) на человека в Сингапуре. Городские власти уже начали сажать деревья в рамках программы после многих лет потери деревьев в городах из-за развития инфраструктуры.

Тем не менее, Фук сказал, что его удивил такой акцент на городах. «Когда вьетнамцы слышат о миллиардах деревьев, мы думаем о лесах, — сказал он.Из такого количества деревьев можно создать до 500 000 гектаров (1,2 миллиона акров) нового леса, но план MARD предусматривает посадку всего 80 000 гектаров (198 000 акров), а остальные деревья уйдут в урбанизированные районы, добавил он.

Посадку деревьев по приказу центрального правительства можно проследить до покойного бывшего президента Хо Ши Мина, который начал новогоднюю традицию сажать деревья по лунному календарю в 1959 году, когда Вьетнам был разделен на две страны.

Согласно еще не опубликованному исследовательскому документу от 2020 года о крупномасштабных программах лесовосстановления во Вьетнаме, в 1992 году был реализован проект 327 — пятилетняя общенациональная программа лесовосстановления стоимостью 68 миллионов долларов.Однако его критиковали за то, что производство древесины поставили выше продовольственной безопасности и сосредоточили внимание на экзотических породах деревьев, таких как эвкалипт и акация.

В 1998 году правительство представило национальную программу лесовосстановления 5 миллионов гектаров (5MHRP), стоимость которой до 2010 года составила более 1,5 миллиарда долларов, что резко увеличило масштабы проекта 327. 5MHRP не достигла поставленных целей по лесовосстановлению на территории, а в некоторых провинциях поощряла замену естественных кустарников, за счет которых жили местные сообщества, монокультурными плантациями, как правило, акации, которые управляются и периодически вырубаются мелкими землевладельцами.

Мелкие землевладельцы являются важным аспектом лесного хозяйства во Вьетнаме, поскольку они контролируют не менее половины площади лесонасаждений страны, а в сельских районах, таких как горы за пределами Хюэ, плантации являются основным источником дохода для жителей.Плантационные леса обычно приносят меньше экологических выгод, чем естественные лесные экосистемы; например, они меньше укрывают диких животных, меньше защищают от штормов и накапливают меньше углерода.

Несмотря на эти недостатки, такие инициативы, как проект 327 и 5MHRP, действительно повлияли на показатели необработанных лесов. Согласно данным доклада 2020 года, лесной покров Вьетнама вырос с 28% территории страны, или 9,4 миллиона гектаров (23 миллиона акров), в 1990 году до 42%, или 14,6 миллиона гектаров (36 миллионов акров), в 2020 году.По данным Open Development Mekong, за это время росли как естественные леса, так и плантации, но плантации росли быстрее. По состоянию на 2016 год естественные леса составляли около 71% от общего лесного покрова; из них только 0,25% составляют девственные леса.

«С одной стороны, лесной покров расширился, поэтому, если это ваш показатель, то лесовозобновление было в некоторой степени успешным», — сказала Памела МакЭлви, доцент кафедры экологии человека в Университете Рутгерса в Нью-Джерси, США, которая является соавтором программы 2020 года. бумага.«Но в нем ничего не говорится о качестве лесов и их долгосрочном статусе».

МакЭлви сказал, что существуют серьезные региональные различия в способах восстановления лесов, учитывая разнообразную географию Вьетнама. В то время как полосы центрального Вьетнама теперь покрыты плантациями неместной акации для сбора урожая, части дельты Меконга успешно расширились или, по крайней мере, сохранили местный мангровый лесной покров, который должен оставаться на месте и защищать прибрежные сообщества.

При спуске в город Хюэ в центральном Вьетнаме регион кажется бескрайним простором лесных холмов и гор. Однако на уровне земли становится очевидным, что это уловка: миля за милей монокультурные плантации, в основном выращивающие акацию, покрывают низины и предгорья, ведущие к изрезанной границе с Лаосом.

Акация не является уроженцем Вьетнама, но она стала доминировать в этом ландшафте, где тысячи мелких землевладельцев выращивают ее во время уборки урожая продолжительностью до семи лет для производства бумаги и древесины.

Лесной сектор имеет большое экономическое значение, поскольку Управление лесного хозяйства Вьетнама намеревается достичь в этом году экспорта в 14 миллиардов долларов.

«Итак, акация кладет деньги в карманы людей, но она приводит к расслоению земель, и не всем это приносит пользу», — сказал МакЭлви.«В других местах [во Вьетнаме] есть разные модели, например, некоторые модели мангровых зарослей основаны на более разнообразной экологии, но этого не происходит с акацией: это один вид, и ничего другого нет, и это не то, о чем люди думают. как лес ».

Кроме того, высокие тонкие деревья акации легко повалить при сильном ветре, поднимая почву и повышая риск оползней.

Район Хыонг Ча, расположенный недалеко от Хюэ в провинции Тхуа Тхиен-Хюэ, пострадал от прошлогодних штормов, а рядом с ним произошла серия оползней, похоронивших 17 рабочих на плотине гидроэлектростанции, что положило начало драматической спасательной операции с участием вьетнамских военных. Только шесть тел были обнаружены.

Бесконечные плантации акации, виды которых поощрялись и субсидировались предыдущими программами лесовосстановления, простираются от узкой рябой дороги, ведущей к долине. Чередование урожая на небольших участках создает лоскутное одеяло из 12-метровых (40-футовых) деревьев рядом с только что расчищенной землей.

Фермер, пожелавший остаться неназванным, чтобы свободно говорить о своем экономическом положении, сидел за стойлом с напитками, делая перерыв в уходе за своей землей.

«Я переехал сюда в 2002 году, чтобы начать выращивать акацию», — сказал он по-вьетнамски.«Если я продаю их на материал для изготовления бумаги, они растут четыре или пять лет, но чтобы получить древесину, нужно больше семи лет. С экономической точки зрения, это не так много, а за почвой очень сложно ухаживать ».

Его простой бетонный дом внизу по дороге свидетельствует о его скудном доходе. По словам фермера, если он вырастит 1 гектар (2,5 акра) акации в течение пяти лет, он может продать его за 3470 долларов прибыли или всего 58 долларов в месяц — и это считается хорошей продажной ценой. У него около 3 га (7.4 акра) акации и выращивает джекфрут, манго и банановые деревья вокруг своего дома для дополнительного дохода, поскольку почва на дне долины богаче, чем на склонах холмов.

«Деревья акации не удерживают воду или почву, поэтому, когда идет дождь, любая хорошая почва сходит с холма», — сказал он. «В самых высоких частях холмов дереву может потребоваться 10 лет, чтобы достичь высоты, которой оно обычно достигает за семь лет».

Когда его спросили, посадили ли он или его соседи что-нибудь кроме акации, он ответил, что это все, что они знают: «Но если бы я узнал о проектах с использованием других видов, я бы с удовольствием узнал о них.”

Фактически, такие усилия по лесовосстановлению ведутся по всему Вьетнаму благодаря природоохранным НПО, таким как WWF Вьетнама и PanNature, а также по инициативе отдельных фермеров.

«Во Вьетнаме мы слишком много внимания уделяем инициативам по посадке деревьев, где мы просто пытаемся увеличить лесной покров — везде, где есть деревья, он может считаться лесом — и мы хотим больше сосредоточиться на качестве и устойчивости этой деятельности», — сказал Нгуен Хай Ван, заместитель директора PanNature. «В предыдущих программах мы сажали быстрорастущие деревья, такие как акация, но долгое время никто не говорил об их устойчивости, и по этому поводу возникает очень много вопросов».

PanNature работает с местными сообществами, особенно с группами этнических меньшинств, в Центральном нагорье и горном северо-западе, чтобы возродить традиционные методы управления лесами.

«Мы стараемся восстановить леса и очень внимательно относимся к тому, какие виды пород мы предоставляем местному населению для посадки», — сказал Ван. «Мы учитываем качество почвы, микроклимат, соответствует ли она естественной экосистеме, какую ценность и пользу люди могут получить, если посадят это дерево».

Нгуен Дык То Луу, менеджер программы управления ресурсами PanNature, добавил, что они не уделяют особого внимания деревьям; вместо этого они смешиваются с кустарниками, лекарственными и фруктовыми растениями. Это дает людям, которые полагаются на лес как источник средств к существованию, более разнообразный источник дохода, а также позволяет избежать ловушек, связанных с плантациями монокультур.

«Мы не идем на большие плантации промышленных пород, вместо этого мы хотим использовать небольшие проекты, проводимые местным населением с использованием многоцелевых пород и смешанных насаждений, а не только древесины», — сказал Луу. «Мы поставляем не только саженцы; мы ведем людей от начала производства семян до проектирования плантаций и выбора участков, защиты и ухода. Мы стараемся установить долгосрочные отношения с сообществами, защищающими лес ».

PanNature также недавно обнаружила популяцию находящихся под угрозой исчезновения северных белощекых гиббонов ( Nomascus leucogenys ) рядом с одним из участков своего проекта в Сон-Ла, провинции на удаленном северо-западе.Они планируют посадить фруктовые деревья, которыми могут питаться приматы, расширяя свою среду обитания за счет новых смешанных лесов.

Тем временем в Тхуа Тхиен-Хюэ WWF Вьетнама работает с фермерами, такими как Нгуен Куанг Хоа, над альтернативным методом лесовосстановления, который может стать моделью для программы создания миллиарда деревьев.

«Мы по-прежнему пересаживаем собранную акацию, но в то же время мы также сажаем местные виды, которые живут дольше», — сказал Хоа в своем доме рядом с кладбищем в низинах за пределами Хюэ.«Поэтому, когда фермеры хотят вырастить акацию, они просто срежут ее, а остальные оставят».

Этому проекту всего год, но Хоа привел нас на большую ферму, принадлежащую Фан Ху Тану в районе Хуонг Туи. Площадь владений Тана составляет более 130 гектаров (321 акр), и он намного больше, чем у среднего мелкого землевладельца. За пределами акации он также выращивает апельсины, перец, бананы и маракуйи.

«Раньше я срубил много деревьев и во Вьетнаме, и в Лаосе, а теперь хочу помочь вырастить их снова», — сказал Тан.

При поддержке Всемирного фонда дикой природы Вьетнама он выделил 7 гектаров (17,3 акра) для смешанных посевов, в отличие от акации. Здесь было посажено 500 саженцев местных деревьев среди 3000 акаций на каждом гектаре.

К местным видам относятся индийское красное дерево ( Chukrasia tabularis ) и смоляное дерево ( Dipterocarpus alatus ), а однолетние саженцы полностью затмеваются окружающей их зрелой акацией.

«Мы позволим им вырасти в поколение моих внуков», — сказал Тан.«Но я не хочу сажать их слишком глубоко на территории, так как я не могу следить за всем, и я боюсь, что люди их срубят».

Он сказал, что надеется в конечном итоге расширить территорию смешанных видов до 50 гектаров (124 акра), что позволит добавить в его владение тысячи местных долгоживущих деревьев. Однако Хоа отметил, что для многих экономика акации перевешивает экологические преимущества более разнообразных и здоровых лесов.

«Люди, у которых много земли, вероятно, добровольно пожертвуют часть ее для подобных проектов, но если у них мало земли, они не будут этого делать, потому что они знают, что если они будут выращивать местные деревья, это будут их внуки. которые наследуют их », — сказал он.«Они знают, что сажать акацию работает, и не хотят рисковать».

В то время как любые отходы от полной зависимости от акации в центральном Вьетнаме остаются относительно небольшими, это тенденция, которую хотят видеть такие специалисты по лесному хозяйству, как Ван, Фук и МакЭлви.

«Если мы собираемся говорить о долгосрочной адаптации, я бы хотел, чтобы провинциальные отделы лесного хозяйства начали говорить о том, что акация не является подходящим видом в этом контексте», — сказал МакЭлви.«Это не прочный, глубоко укоренившийся вид, но нельзя полагаться на то, что мелкие фермеры сами отойдут от него. Они просто не могут себе этого позволить, поэтому, если вы хотите зарабатывать деньги на более разнообразном естественном лесу, вам нужны более долгосрочные субсидии. У вас должны быть деньги для домашних хозяйств, поскольку они ждут долгосрочной смены древесины ».

Пока еще неизвестно, какие леса программа по выращиванию миллиарда деревьев установит в высокогорных районах, Фук из Forest Trends сказал, что, в конечном итоге, поиск доступных земель для посадки новых деревьев может оказаться там самой большой проблемой для программы.

«Есть довольно много земли, которую можно использовать, но ею управляют местные домохозяйства, и вы не можете сказать им, чтобы они сажали деревья так, как вы хотите», — сказал он. «На бумаге около миллиона гектаров [2,5 миллиона акров] управляется местными властями, но на самом деле сельские жители уже использовали его для возделывания земель. Найти землю чрезвычайно сложно, и одна из причин, по которой 5MHRP не удалось, заключается в том, что просто не хватило земли для посадки деревьев ».

Это, по словам Фука, основная причина, по которой правительство уделяет внимание городским районам, когда дело доходит до посадки в течение следующих пяти лет, несмотря на то, что оно разработало программу создания миллиарда деревьев в контексте разрушительных оползней и наводнений в горных районах.

В конечном счете, именно жители быстрорастущих городов Вьетнама могут получить наибольшую выгоду от этой последней общенациональной кампании по посадке деревьев. Дополнительный городской древесный покров поможет бороться с ухудшением загрязнения воздуха и уменьшить эффект острова тепла, вызванный интенсивной застройкой.

Тем временем такие фермеры, как Хоа и Тан, останутся среди уязвимых ландшафтов на линии огня ежегодного сезона тайфунов в стране, который, как ожидается, в будущем станет более интенсивным из-за изменения климата.

Изображение баннера: Тропический лес в национальном парке Кук Фыонг, Вьетнам. Изображение Ретта А. Батлера.

ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ: Используйте эту форму, чтобы отправить сообщение редактору этого сообщения. Если вы хотите опубликовать публичный комментарий, вы можете сделать это внизу страницы.

STM / BP-подобный KNOXI не связан с ARP в регуляции развития сложных листьев у Medicago truncatula | Растительная клетка

Аннотация

Class I KNOTTED Гены -подобных гомеобоксов ( KNOXI ) имеют решающее значение для поддержания апикальной меристемы побегов.Домен экспрессии KNOXI регулируется генами ASYMMETRIC LEAVES1 / ROUGHSHEATh3 / PHANTASTICA ( ARP ), которые связаны с морфологией листа. В кладе с инвертированным отсутствием повторов (IRLC) Fabaceae ортологи LEAFY ( LFY ) функционируют вместо KNOXI , регулируя развитие сложного листа. Здесь мы охарактеризовали мутанты с потерей функции ARP ( PHAN ) и SHOOTMERISTEMLESS ( STM ) — и BREVIPEDICELLUS ( BP ) -подобной ноги KNOXI вид Medicago truncatula .Функция генов ARP видоспецифична. Репрессия STM / BP-подобных генов KNOXI в листьях не опосредована PHAN , и не наблюдалась супрессия PHAN STM / BP-подобных генов KNOXI , что указывает на то, что STM / BP-подобные гены KNOXI не связаны с PHAN в M. truncatula . Кроме того, сравнительный анализ фенотипического выхода в ответ на эктопическую экспрессию KNOXI и M.truncatula LFY , ортолог SINGLE LEAFLET1 ( SGL1 ), показывают, что KNOXI и SGL1 регулируют параллельные пути в развитии листа. Мы предполагаем, что SGL1 , вероятно, функционирует специфическим для стадии образом в регуляции неопределенного состояния развивающихся листьев у M. truncatula .

ВВЕДЕНИЕ

KNOTTED-подобные гомеобоксы (KNOX) белки регулируют как эмбриональное, так и постэмбриональное развитие растений.Гены KNOX делятся на два подкласса: класс I KNOX ( KNOXI ) и класс II KNOX ( KNOXII ) на основе сходства последовательностей, структуры гена и характера экспрессии (Hay and Tsiantis, 2010). Гены KNOXI , которые эволюционно близки к кукурузе ( Zea mays ) KN1 (Vollbrecht et al., 1991), экспрессируются в апикальной меристеме побегов (SAM) как однодольных, так и эвдикотовых растений и играют решающую роль в их развитии. поддержание SAM и регуляция сложности листа у сосудистых растений (Long et al., 1996; Hake et al., 2004; Баркулас и др., 2008; Хэй, Циантис, 2010). KNOXII гены обнаруживают различные паттерны экспрессии, и их функция не ясна (Serikawa et al., 1997; Byrne et al., 2002).

Семейство генов KNOXI из Arabidopsis thaliana состоит из SHOOTMERISTEMLESS ( STM ), BREVIPEDICELLUS ( BP ) / KNOTTED 910 1 , аналогичных A. KNAT2 и KNAT6 (Lincoln et al., 1994; Long et al., 1996). STM экспрессируется во время раннего эмбриогенеза и маркирует всю SAM. Мутант с потерей функции stm не смог установить SAM во время эмбриогенеза (Long et al., 1996; Belles-Boix et al., 2006). BP избыточно способствует поддержанию SAM с STM (Byrne et al., 2002; Venglat et al., 2002), а потеря BP растений показала умеренно карликовый фенотип. KNAT2 и KNAT6 показали дублирующие и антагонистические роли с генами KNOXI (Belles-Boix et al., 2006; Ragni et al., 2008). В SAM белки KNOXI увеличивают уровень цитокинина (CK) за счет активации экспрессии гена биосинтеза CK ISOPENTENYL TRANSFEREASE7 и снижают уровень гибберелловой кислоты путем ингибирования гена GA 2-оксидазы 1 (Sakamoto et al., 2001; Jasinski et al., 2005; Yanai et al., 2005; Bolduc, Hake, 2009). Такие условия с высоким содержанием CK и низким содержанием гибберелловой кислоты необходимы SAM для поддержания своей активности. Эктопическая экспрессия генов KNOXI значительно изменяла развитие листьев (Lincoln et al., 1994; Belles-Boix et al., 2006; Шани и др., 2009). У видов с простыми листьями, таких как Arabidopsis , у трансгенных растений, сверхэкспрессирующих KNOXI , наблюдали лопастной край листа. Однако у видов со сложными листьями сверхэкспрессия генов KNOXI резко увеличивает степень повторения листочков (Hareven et al., 1996; Hay and Tsiantis, 2006).

A MYB, фактор транскрипции , АСИММЕТРИЧЕСКИЕ ЛИСТЬЯ1 ( AS1 ) в Arabidopsis , ROUGH SHEATh3 ( RS2 ) в кукурузе и PHANTICA вместе известные как факторы ARP ) является негативным регулятором генов KNOXI (Waites et al., 1998; Тиммерманс и др., 1999; Циантис и др., 1999; Бирн и др., 2000; Guo et al., 2008; Lodha et al., 2013). Формы листьев можно разделить на два основных типа: простые листья и сложные листья. Простая створка состоит из одного неразделенного лезвия, а составная пластина состоит из нескольких прерывистых лезвий. Регуляторный модуль ARP-KNOXI хорошо известен у видов с простыми листьями. У Arabidopsis взаимоисключающий паттерн экспрессии наблюдается между AS1 и STM на верхушке побега. STM репрессирует экспрессию AS1 в презумптивных стволовых клетках для поддержания недифференцированного меристематического состояния (Byrne et al., 2000). Кроме того, белки ARP действуют в листе, ограничивая KNOXI, например BP, в SAM. Взаимоисключающие домены экспрессии ARP и KNOXI отличает клетку-основатель листа от судьбы меристемных клеток в SAM (Long et al., 1996; Hay and Tsiantis, 2006). Напротив, некоторые виды со сложными листьями, такие как томат ( Solanum lycopersicum ) и Cardamine hirsuta , демонстрируют реактивацию экспрессии KNOXI во время развития листа.У этих видов наблюдалось перекрытие доменов экспрессии ARP и KNOXI (Hareven et al., 1996; Bharathan et al., 2002; Hay and Tsiantis, 2006; Champagne et al., 2007; Shani et al. ., 2009). Однако анализ экспрессии ARP и KNOXI в горохе ( Pisum sativum ), бобовых со сложными листьями, принадлежащими к кладе с большим инвертированным повторением (IRLC), показывает, что они экспрессируются в дополнительных доменах, таких как простые — листовые виды и в отличие от томатов (Tattersall et al., 2005).

Отсутствие экспрессии KNOXI в зачатках листьев группы IRLC указывает на то, что генов KNOXI могут не участвовать в формировании сложных листьев у этих бобовых (Hofer et al., 2001; Champagne et al., 2007). Дальнейшие исследования показывают, что предполагаемые ортологи FLORICAULA / LEAFY ( LFY ), гороха UNIFOLIATA ( UNI ) и Medicago truncatula SINGLE LEAFLET1 (I ) регулируют функцию SGLET1 (I ) вместо K развитие сложного листа (Hofer et al., 1997; Войцеховски и др., 2004; Champagne et al., 2007; Wang et al., 2008). Эти результаты вызывают вопросы о том, сохраняется ли регуляторная цепь ARP — KNOXI в IRLC, поскольку процесс развития сложного листа сместился от модуля, опосредованного KNOXI, и как ортологи LFY берут на себя роль в соединении. узор листьев в IRLC. Однако отсутствие мутантов с потерей функции KNOXI и ARP в бобовых препятствует пониманию этого особого генетического механизма регуляции образования сложных листьев.Здесь мы решаем эти вопросы, охарактеризовав мутанты Tnt1, , меченные ретротранспозоном ARP, и STM / BP-подобных KNOXI в модельной бобовой M. truncatula . Мы показываем, что M. truncatula ARP ( PHAN ) и STM / BP-подобных генов KNOXI обладают консервативными функциями. Однако никаких генетических взаимодействий между PHAN и STM / BP-подобных генов KNOXI не наблюдалось, что позволяет предположить, что STM / BP-подобных генов KNOXI не связаны с PHAN .Кроме того, различные ответы на эктопическую экспрессию KNOXI и SGL1 показывают, что KNOXI и SGL1 регулируют параллельные пути в развитии листа, а SGL1 , вероятно, функционирует в зависимости от стадии, регулируя неопределенное состояние развития. листья в M. truncatula . Сравнение этих эффектов развития также проливает свет на возможную роль др. Регуляторов в формировании сложного паттерна листа.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация

Для выявления дополнительных регуляторов, контролирующих развитие листа, была проведена проверка мутантной популяции M. truncatula (~ 13 000 независимых линий), генерируемой табаком ( Nicotiana tabacum ) Tnt1 инсерционного мутагенеза ретротранспозона (Tadege et al., 2008). Была идентифицирована одна мутантная линия, NF2810, с явными изменениями морфологии листа. По сравнению с диким типом, мутантное растение имело загнутые вниз листья с ярко выраженными зубцами на краю листа и игольчатыми прилистниками (рисунки 1A-1D), а иногда и листья с эктопическими листочками и асимметричными боковыми листочками (дополнительные рисунки 1A и 1B). .Кроме того, мутантные листья имели удлиненные зазубренные кончики на краю (дополнительные рисунки 1C и 1D). На репродуктивной стадии длина черешка у мутанта была значительно уменьшена, что указывает на сжатие проксимально-дистальной оси листа (Рисунки 1C и 1E). Однако длина рахиса у мутанта не показала значительных изменений (рис. 1F). Анализ с помощью сканирующей электронной микроскопии показал, что длина эпидермальных клеток черешка у мутанта была резко уменьшена по сравнению с таковой у дикого типа, что позволяет предположить, что уменьшенная длина клеток объясняет укороченный черешок у мутанта (рисунки 1G и 1H).Длина эпидермальных клеток рахиса была неотличима между мутантом и диким типом, но клетки в мутанте казались более тонкими (Фигуры 1I и 1J). Кроме того, были исследованы эпидермальные клетки листьев, и не было обнаружено очевидных различий между мутантом и диким типом (дополнительные рисунки с 1E по 1H). Анатомический анализ показал, что 30% средних жилок мутантного листа имели эктопические сосудистые пучки ( n = 10). Более того, флоэма была увеличена на абаксиальной стороне листа мутанта по сравнению с таковой у дикого типа (Фигуры 1K и 1L).Расширенная флоэма также наблюдалась на черешке мутанта, что позволяет предположить, что листья мутанта были частично абаксиализированы (дополнительные рисунки 1I и 1J).

Рисунок 1.

Дефекты развития листа у мутантного растения.

(A) и (B) Адаксиальная сторона (A) и абаксиальная сторона (B) полностью распустившихся листьев 45-дневных растений дикого типа и мутантных (NF2810) растений на вегетативной стадии сцена.

(C) Полностью разросшиеся листья 80-дневных растений дикого типа и мутантных (NF2810) растений на репродуктивной стадии.Стрелка указывает на укороченный черешок мутанта.

(D) Прилистники дикого типа и мутант.

(E) и (F) Длина черешка (E) и рахиса (F) дикого типа и мутанта на разных стадиях развития. DAG, дни после прорастания. Числа представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 10). ** P <0,01.

(G) от до (J) Изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа эпидермальных клеток черешка ( [G] и [H] ) и позвоночника ( [I] и [J] ) из 80-дневных растений дикого типа и мутантных растений.

(K) и (L) Поперечные срезы сосудистых пучков в средних жилках листа дикого типа (K) и мутанта (L) . Стрелка указывает на эктопический сосудистый пучок. На вставках в (K), и (L), показан увеличенный вид сосудистых пучков (области в рамке). Ph, флоэма; X, ксилема; AD, адаксиальная сторона; AB, абаксиальная сторона.

Штанги = 1 см для (A) от до (C) , 5 мм для (D) , 50 мкм для (G) от до (J) и 200 мкм для (K ) и (L) .

[Цветную версию этого рисунка см. В онлайн-статье.]

Рисунок 1.

Дефекты развития листьев у мутантных растений.

(A) и (B) Адаксиальная сторона (A) и абаксиальная сторона (B) полностью распустившихся листьев 45-дневных растений дикого типа и мутантных (NF2810) растений на вегетативной стадии сцена.

(C) Полностью разросшиеся листья 80-дневных растений дикого типа и мутантных (NF2810) растений на репродуктивной стадии. Стрелка указывает на укороченный черешок мутанта.

(D) Прилистники дикого типа и мутант.

(E) и (F) Длина черешка (E) и рахиса (F) дикого типа и мутанта на разных стадиях развития. DAG, дни после прорастания. Числа представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 10). ** P <0,01.

(G) от до (J) Изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа эпидермальных клеток черешка ( [G] и [H] ) и позвоночника ( [I] и [J] ) из 80-дневных растений дикого типа и мутантных растений.

(K) и (L) Поперечные срезы сосудистых пучков в средних жилках листа дикого типа (K) и мутанта (L) . Стрелка указывает на эктопический сосудистый пучок. На вставках в (K), и (L), показан увеличенный вид сосудистых пучков (области в рамке). Ph, флоэма; X, ксилема; AD, адаксиальная сторона; AB, абаксиальная сторона.

Штанги = 1 см для (A) от до (C) , 5 мм для (D) , 50 мкм для (G) от до (J) и 200 мкм для (K ) и (L) .

[Цветную версию этого рисунка см. В статье в Интернете.]

YABBY и HD-ZIP III Семейства генов участвуют в создании абаксиальных и адаксиальных доменов, соответственно (Moon and Hake, 2011; Townsley and Sinha , 2012). Для дальнейшей оценки дефектов полярности листьев у мутанта были проанализированы уровни экспрессии генов YABBY и HD-ZIP III (дополнительный рисунок 2 и дополнительные наборы данных 1 и 2). Уровни транскриптов членов гена HD-ZIP III варьировали между диким типом и мутантом, но большинство генов YABBY были активированы у мутанта, что подтверждает наблюдение абаксиализированных листьев у мутанта.В дополнение к дефектам морфологии листьев, также было затронуто развитие цветка у мутанта (дополнительные рисунки с 3А по 3J). Ширина цветковых органов, таких как вексиллум, была уменьшена у мутанта (дополнительная фигура 3К). Цветки смогли развиться в семенные коробочки, но их количество у мутанта было меньше, чем у дикого типа (дополнительный рисунок 3L).

Мутантный фенотип связан с

Для идентификации гена, ассоциированного с мутантным фенотипом, была проведена термическая асимметричная чересстрочная ПЦР для извлечения фланкирующих последовательностей ретротранспозона Tnt1 из мутанта.На основании результатов генотипирования ПЦР была идентифицирована одна фланкирующая последовательность, расщепляющаяся с мутантным фенотипом. Полноразмерную геномную последовательность получали с использованием этой фланкирующей последовательности для поиска геномных последовательностей M. truncatula в базе данных Национального центра биотехнологической информации. Полноразмерную кодирующую последовательность из 1080 нуклеотидов получали с помощью ОТ-ПЦР. Сопоставление кодирующей последовательности (CDS) и геномной последовательности показало, что один интрон расположен в 5′-нетранслируемой области гена (рис. 2А).Геномный ПЦР-анализ выполняли для обнаружения сайта вставки ретротранспозона Tnt1 . В то время как фрагмент ПЦР размером ~ 1,1 т.п.н. был амплифицирован в диком типе, фрагмент ПЦР размером ~ 6,4 т.п.н., содержащий единственный ретротранспозон Tnt1 (~ 5,3 т.п.н.), был амплифицирован в мутанте (рис. 2В). Сравнение последовательностей показало, что ретротранспозон Tnt1 был вставлен в 3′-конец второго экзона этого гена (рис. 2А; дополнительная таблица 1). Анализ RT-PCR показал, что полноразмерные транскрипты были прерваны у мутанта (рис. 2C).Количественный анализ RT-PCR (qRT-PCR) выполняли для измерения уровней экспрессии генов с использованием праймеров, разработанных для амплификации фрагментов выше и ниже сайта вставки Tnt1 . Результаты показали, что уровни транскрипта этого гена были очень низкими (<9%) у мутанта по сравнению с таковым у дикого типа (дополнительная фигура 4). Филогенетический анализ показал, что этот ген является членом семейства белков MYB-домена и эволюционно ближе к гену ARP гороха CRISPA ( CRI ), который является ортологом A.majus PHAN (рис. 2D; дополнительный набор данных 3) (Waites et al., 1998). Анализ BLAST был выполнен в отношении базы данных геномных последовательностей M. truncatula (версия Mt4.0V1, www.jcvi.org/medicago/), и была обнаружена только одна копия этого гена. Сравнение аминокислотных последовательностей выявило высокое сходство последовательностей между этим белком и белками ARP из других видов растений (дополнительный рисунок 5). На основании этих данных этот ген идентифицирован как предполагаемый ортолог ARP в M.truncatula и назван PHAN . Недавно был описан мутант PHAN с меткой Tnt1 (Ge et al., 2014). Поскольку вставка Tnt1 расположена в том же положении в последовательностях белка PHAN мутантов, аллель PHAN (Ge et al., 2014) идентичен таковому в этом исследовании.

Рисунок 2.

Молекулярное клонирование PHAN в M. truncatula .

(A) Структура гена PHAN и сайт вставки Tnt1 .Прямоугольники представляют экзоны, а линии — интрон. Вертикальной стрелкой отмечено расположение ретротранспозона Tnt1 в мутанте phan . Горизонтальными стрелками отмечен фрагмент гена, использованный для конструирования трансгена PHAN _RNAi .

(B) Идентификация с помощью ПЦР мутанта phan . В мутанте амплифицировали фрагмент ПЦР размером ~ 6,4 т.п.н., содержащий единственный ретротранспозон Tnt1 (~ 5,3 т.п.н.). Трансгенные растения дикого типа и PHAN _RNAi, использовали в качестве контроля.

(C) RT-PCR анализ полноразмерных транскриптов транскриптов PHAN в вегетативных почках мутанта phan и трансгенных растений PHAN _RNAi . ACTIN использовали в качестве контроля.

(D) Филогенетический анализ генов PHAN и ARP других видов. Выравнивания, используемые для генерации филогении, представлены в дополнительном наборе данных 3.

(E) Листья PHAN _RNAi трансгенных растений имитируют фенотип phan .

(F) и (G) Генетическая комплементация phan . Типичные листья phan и phan , трансформированные конструкцией PHANpro: PHAN , показаны в (F) и (G) , соответственно.

Штанги = 1 см для дюймов (E) от до (G) .

[Цветную версию этого рисунка см. В онлайн-статье]

Рисунок 2.

Молекулярное клонирование PHAN в M.truncatula .

(A) Структура гена PHAN и сайт вставки Tnt1 . Прямоугольники представляют экзоны, а линии — интрон. Вертикальной стрелкой отмечено расположение ретротранспозона Tnt1 в мутанте phan . Горизонтальными стрелками отмечен фрагмент гена, использованный для конструирования трансгена PHAN _RNAi .

(B) Идентификация с помощью ПЦР мутанта phan . Фрагмент ПЦР размером ~ 6,4 т.п.н., содержащий один ретротранспозон Tnt1 (~ 5.3 т.п.н.) был амплифицирован в мутанте. Трансгенные растения дикого типа и PHAN _RNAi, использовали в качестве контроля.

(C) RT-PCR анализ полноразмерных транскриптов транскриптов PHAN в вегетативных почках мутанта phan и трансгенных растений PHAN _RNAi . ACTIN использовали в качестве контроля.

(D) Филогенетический анализ генов PHAN и ARP других видов.Выравнивания, используемые для генерации филогении, представлены в дополнительном наборе данных 3.

(E) Листья PHAN _RNAi трансгенных растений имитируют фенотип phan .

(F) и (G) Генетическая комплементация phan . Типичные листья phan и phan , трансформированные конструкцией PHANpro: PHAN , показаны в (F) и (G) , соответственно.

Штанги = 1 см для дюймов (E) от до (G) .

[Цветную версию этого рисунка см. В онлайн-статье.]

Чтобы еще раз подтвердить, что вставка Tnt1 в PHAN отвечает за мутантный фенотип, был проведен обратный генетический скрининг пулов ДНК из пулов Tnt1 с меткой Tnt1 . Была проведена мутантная популяция (Tadege et al., 2008), но не удалось обнаружить дополнительных аллелей phan из ~ 18 000 мутантных линий. Чтобы исключить возможность того, что фенотип phan вызван другими неизвестными мутациями, были получены растения с нокдауном PHAN с использованием РНК-интерференции ( PHAN _RNAi ).Уровень экспрессии PHAN был резко снижен в трансгенных растениях PHAN _RNAi (рис. 2C). Фенотип листьев трансгенных растений напоминал фенотип phan (рис. 2E). Кроме того, геномный фрагмент, включающий промотор и кодирующую последовательность PHAN , был стабильно введен в растения phan . Фенотип мутанта phan был полностью дополнен (фиг. 2F и 2G). В совокупности эти данные подтверждают, что потеря функции PHAN привела к дефектам развития мутанта.Анализ паттернов экспрессии на основе Атласа экспрессии генов M. truncatula выявил относительно высокие уровни PHAN в вегетативных почках, семенах и стручках (дополнительная фигура 6A). Для более полного определения характера экспрессии был сконструирован репортерный ген промотор PHAN -GUS (β-глюкуронидаза) и введен в растения дикого типа. Экспрессия GUS была обнаружена почти во всех органах (дополнительные рисунки с 6B по 6J), что указывает на широкую роль PHAN в развитии M.truncatula .

Было показано, что сверхэкспрессия AS1 в Arabidopsis приводила к образованию удлиненных и скрученных вниз листьев (Theodoris et al., 2003), а сверхэкспрессия Sl- PHAN в томатах и ​​табаке приводила к эктопическому разрастанию лезвий (Zoulias et al. др., 2012). Чтобы исследовать эффекты эктопической экспрессии PHAN , трансген PHAN , управляемый промотором 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV), был введен в организм дикого типа.Трансгенные растения не проявляли каких-либо очевидных изменений в морфологии листьев, что позволяет предположить, что повышенная активность ARP приводит к различным ответным реакциям развития у разных видов (дополнительные рисунки 6K и 6L).

В предыдущем отчете три гена класса I ( KNOXI ) и три класса II ( KNOXII ) KNOX были изолированы в M.truncatula (Di Giacomo et al., 2008). При поиске BLAST в базе данных геномов M. truncatula (версия Mt4.0V1, www.jcvi.org/medicago/) были обнаружены два дополнительных гена KNOXI и два дополнительных гена KNOXII . Филогенетический анализ показал, что KNOX1 и KNOX6 были STM-подобными генами класса I; KNOX2 был геном класса I, подобным п.н .; и KNOX7 и KNOX8 были KNAT2 / 6-подобными генами класса I (дополнительная фигура 7).Кроме того, анализ Expression Atlas показал, что гены KNOX1 , 2 и 6 демонстрируют сходные паттерны экспрессии, которые отличаются от паттернов KNOX7 и KNOX8 (дополнительная фигура 8). Для начала мы сосредоточились на KNOX1 , KNOX2 и KNOX6 , потому что консервативный регуляторный модуль был зарегистрирован в основном между STM / BP-подобными генами KNOXI и ARP (Kim et al., 2003b; Луо и др., 2005; Tattersall et al., 2005; Хэй и Циантис, 2006). Предыдущие исследования показали, что эктопическая экспрессия генов KNOXI у видов с сложными листьями приводит к резкому увеличению сложности листа за счет стимулирования биосинтеза ЦК (Hareven et al., 1996; Jasinski et al., 2005; Yanai et al., 2005; Hay, Tsiantis, 2006; Champagne et al., 2007). Чтобы исследовать, играют ли KNOXI гены такие роли в M. truncatula, , KNOX1 , KNOX2 и KNOX6 под контролем конститутивного промотора 35S CaMV были введены в дикого типа.Один из генов KNOXII , KNOX4 , также был сверхэкспрессирован в качестве контроля. Трансгенные растения ( OX-KNOXI ) с повышенными уровнями экспрессии STM / BP-подобных генов KNOXI демонстрировали аналогичное повторение листочков более высокого порядка вдоль удлиненных черешков, также наблюдались вариации в количестве и форме листочков (рисунки 3A — 3F). ). Эти наблюдения демонстрируют, что эктопическая STM / BP-подобная активность KNOXI достаточна для увеличения сложности листа у M.truncatula . Трансгенные растения, сверхэкспрессирующие KNOX4 , не показали очевидных изменений в морфологии листа, что свидетельствует о различных функциональных ролях между генами KNOXI и KNOXII (фигура 3G).

Рисунок 3.

Функциональный анализ генов KNOXI в M. truncatula .

(A) от до (C) Трансгенные растения со сверхэкспрессией Pro35S: KNOX1 , Pro35S: KNOX2 и Pro35S: KNOX6 .

(D) Изображение, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа, показывает типичный лист, полученный из трансгенных растений Pro35S: KNOX1 . Внематочный листочек (наконечник стрелки) развивается вдоль черешка, а листочки более высокого порядка развиваются (стрелка). ПЭ, черешок.

(E) и (F) Типичный лист, полученный из трансгенного растения Pro35S: KNOX2 (E) и его схематическое изображение (F) . Показано резкое увеличение сложности листа.

(G) Типичный лист, полученный из трансгенного растения Pro35S: KNOX4 .

Штанги = 1 см для (A) от до (C) , (E) и (G) и 200 мкм для (D) .

[Цветную версию этого рисунка см. В онлайн-статье]

Рисунок 3.

Функциональный анализ генов KNOXI в M. truncatula .

(A) от до (C) Трансгенные растения со сверхэкспрессией Pro35S: KNOX1 , Pro35S: KNOX2 и Pro35S: KNOX6 .

(D) Изображение, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа, показывает типичный лист, полученный из трансгенных растений Pro35S: KNOX1 . Внематочный листочек (наконечник стрелки) развивается вдоль черешка, а листочки более высокого порядка развиваются (стрелка). ПЭ, черешок.

(E) и (F) Типичный лист, полученный из трансгенного растения Pro35S: KNOX2 (E) и его схематическое изображение (F) . Показано резкое увеличение сложности листа.

(G) Типичный лист, полученный из трансгенного растения Pro35S: KNOX4 .

Штанги = 1 см для (A) от до (C) , (E) и (G) и 200 мкм для (D) .

[Цветную версию этого рисунка см. В статье в Интернете.]

Было показано, что правильный транспорт ауксина, регулируемый PIN-FORMED1 ( PIN1 ) и AS1 , сходится к репрессии экспрессии BP в Arabidopsis , и дефекты мутанта pin1 частично устраняются в двойной мутант pin1 по (Hay et al., 2006). Ортолог PIN1 , SMOOTH LEAF MARGIN1 ( SLM1 ), был идентифицирован у M. truncatula (Zhou et al., 2011). Распределение ауксина нарушено в мутанте slm1 , что указывает на консервативную роль SLM1 в транспорте ауксина. Чтобы определить, является ли модуль ауксин / SLM1 возможным репрессором STM / BP-подобного KNOXI в M. truncatula , уровни экспрессии генов KNOXI были проанализированы в мутанте slm1 (фиг. 7A).Уровни транскриптов генов KNOX1 , 2 и 6 остались практически неизменными в slm1 , что указывает на то, что SLM1 не участвует в репрессии генов KNOXI . Чтобы дополнительно проверить, вносит ли пространственная и временная экспрессия STM / BP-подобных генов KNOXI вклад в дефекты slm1 , генерировались двойные, тройные и четверные мутанты среди мутантов slm1 и knoxi (Рисунок 7B).Фенотип двойного мутанта slm1-1 knox2-1 аналогичен фенотипу slm1-1 . С другой стороны, тройной мутант slm1-1 knox1-1 knox6-1 является полукарликом, демонстрируя меньшее количество кластерных листьев и укороченных стеблей. Инициирование листка было сильно снижено, когда все три гена KNOXI были одновременно нарушены в slm1-1 . Эти наблюдения подтверждают, что SLM1, и STM / BP-подобные гены KNOXI , вероятно, действуют избыточно при инициации листьев.Однако дефекты развития цветков и производства семян в slm1 не могли быть даже частично устранены путем введения различных мутаций knoxi (Рисунок 7C). Этот результат предполагает, что мутантный фенотип slm1 нельзя отнести к STM / BP-подобным генам KNOXI в M. truncatula , который явно отличается от такового в Arabidopsis . Чтобы дополнительно проверить, сходятся ли PHAN и SLM1 для репрессии экспрессии KNOXI , был создан двойной мутант phan slm1 .Листья двойного мутанта phan slm1 показали аддитивный фенотип (фигура 7D). Уровни экспрессии генов KNOX1 , 2 и 6 не изменились в двойном мутанте phan slm1 (рис. 7E), что дополнительно подтверждает, что STM / BP-подобных генов KNOXI не находятся под отрицательным результатом. регулирование SLM1 или PHAN .

Рисунок 7.

Модуль Auxin / SLM1 не является репрессором STM / BP-подобных генов KNOXI .

(A) Уровни экспрессии генов KNOXI в вегетативных почках дикого типа и slm1-1 . Уровни транскрипта измеряли с помощью qRT-PCR. Значения — это средние и стандартные значения трех биологических повторов.

(B) Растения дикого типа и мутанты, полученные в результате различных перекрестных комбинаций среди мутантов slm1-1 и knoxi .

(C) Производство семенных коробочек дикого типа и мутантов. На вставке показан фенотип цветка четырехкратного мутанта slm1-1 (слева) и slm1-1 knox1-1 knox2-1knox6-1 (справа).Стрелки указывают на сросшиеся цветочные органы. Числа представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 5).

(D) Листья двойных мутантов slm1-1 и phan slm1-1 .

(E) Уровни экспрессии генов KNOXI в вегетативных почках дикого типа и двойного мутанта phan slm1-1 . Значения — это средние и стандартные значения трех биологических повторов.

[Цветную версию этого рисунка см. В онлайн-статье.]

Рисунок 7.

Модуль Auxin / SLM1 не является репрессором STM / BP-подобных генов KNOXI .

(A) Уровни экспрессии генов KNOXI в вегетативных почках дикого типа и slm1-1 . Уровни транскрипта измеряли с помощью qRT-PCR. Значения — это средние и стандартные значения трех биологических повторов.

(B) Растения дикого типа и мутанты, полученные в результате различных перекрестных комбинаций среди мутантов slm1-1 и knoxi .

(C) Производство семенных коробочек дикого типа и мутантов. На вставке показан фенотип цветка четырехкратного мутанта slm1-1 (слева) и slm1-1 knox1-1 knox2-1knox6-1 (справа). Стрелки указывают на сросшиеся цветочные органы. Числа представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 5).

(D) Листья двойных мутантов slm1-1 и phan slm1-1 .

(E) Уровни экспрессии генов KNOXI в вегетативных почках дикого типа и двойного мутанта phan slm1-1 .Значения — это средние и стандартные значения трех биологических повторов.

[Цветную версию этого рисунка см. В статье в Интернете.]

Эктопическая экспрессия

(C) и (D) Уровни экспрессии PHAN (C) и SGL1 (D) в вегетативных почках трансгенных растений OX-SGL1 и мутанта phan phan , соответственно.Уровни транскрипта измеряли с помощью qRT-PCR. Значения — это средние и стандартные значения трех биологических повторов.

(E) от до (H) Фенотип листа дикого типа (E) , мутант phan (F) , sgl1 мутант (G) и phan sgl1 double мутант (H) .

(I) Длина черешка в разных узлах у 80-дневных растений дикого типа и мутантных растений. Числа представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 10).** P <0,01.

Штанги = 1 см для (A) и (E) от до (H) и 5 мм для (B) .

Рисунок 8. Функциональный анализ

SGL1 и его генетические взаимодействия с PHAN .

(A) и (B) Типичные листья (A) и прилистники (B) , полученные от трансгенных растений OX-SGL1 . Адаксиальная и абаксиальная стороны листа показаны позицией (A) .Стрелки указывают на загнутый вниз край листа.

(C) и (D) Уровни экспрессии PHAN (C) и SGL1 (D) в вегетативных почках трансгенных растений OX-SGL1 и мутанта phan phan , соответственно. Уровни транскрипта измеряли с помощью qRT-PCR. Значения — это средние и стандартные значения трех биологических повторов.

(E) от до (H) Фенотип листа дикого типа (E) , мутант phan (F) , sgl1 мутант (G) и phan sgl1 double мутант (H) .

(I) Длина черешка в разных узлах у 80-дневных растений дикого типа и мутантных растений. Числа представлены как среднее ± стандартное отклонение ( n = 10). ** P <0,01.

Штанги = 1 см для (A) и (E) от до (H) и 5 мм для (B) .

Было показано, что AS1 репрессирует экспрессию KNAT2 и KNAT6 в дополнение к BP в Arabidopsis (Byrne et al., 2000; Ори и др., 2000; Семиарти и др., 2001; Guo et al., 2008). Чтобы проверить, регулируются ли KNAT2 / 6-подобных генов класса I с помощью PHAN в M. truncatula , была проведена qRT-PCR для анализа уровней экспрессии KNOX7 и KNOX8 в различных тканях. Значительное повышение уровня транскрипта KNOX7 было обнаружено в черешке мутанта phan , в то время как в пластинке листа изменений не обнаружено (Фигуры 9A и 9B).Не было обнаружено значительных различий в экспрессии KNOX8 ни в листовой пластинке, ни в черешке у phan по сравнению с диким типом (фигуры 9A и 9B). Пространственные локализации KNOX7 исследовали с помощью анализа гибридизации in situ. Результаты показали, что KNOX7 экспрессировалось в SAM, но исключено из зарождающихся зачатков листьев (P0) и развивающихся зачатков листьев у дикого типа, что аналогично генам KNOX1 , 2 и 6 .У мутанта phan , однако, эктопическая экспрессия KNOX7 была обнаружена в зачатках P0, и сигнал также обнаруживался в зачатках P1 (Фигуры с 9C по 9F). Эти данные показывают, что KNOX7 может находиться под отрицательной регуляцией PHAN . Дальнейшая идентификация и характеристика мутантов KNOX7 и KNOX8 с потерей функции необходимы для получения более убедительных доказательств.

Рисунок 9.

Экспрессия KNAT2 / 6-подобного гена класса I KNOX7 у дикого типа и мутанта phan .

(A) и (B) Уровни транскриптов KNOX7 и KNOX8 в пластинке листа (A) и черешке (B) дикого типа и мутанта phan . Уровни транскрипта измеряли с помощью qRT-PCR. Значения — это средние и стандартные значения трех биологических повторов. ** P <0,01.

(C) от до (F) Паттерны экспрессии KNOX7 у дикого типа (C) и phan (D) .Показаны продольные разрезы ЗРК. Экспрессия не была обнаружена с использованием контрольного сенсора KNOX7 ( [E] и [F] ). П, пластохрон. Штанги = 50 мкм.

[Цветную версию этого рисунка см. В онлайн-статье.]

Рисунок 9.

Экспрессия KNAT2 / 6-подобного гена класса I KNOX7 у дикого типа и мутанта phan .

(A) и (B) Уровни транскриптов KNOX7 и KNOX8 в пластинке листа (A) и черешке (B) дикого типа и мутанта phan .Уровни транскрипта измеряли с помощью qRT-PCR. Значения — это средние и стандартные значения трех биологических повторов. ** P <0,01.

(C) от до (F) Паттерны экспрессии KNOX7 у дикого типа (C) и phan (D) . Показаны продольные разрезы ЗРК. Экспрессия не была обнаружена с использованием контрольного сенсора KNOX7 ( [E] и [F] ). П, пластохрон. Штанги = 50 мкм.

[Цветную версию этого рисунка см. В онлайн-статье.]

ОБСУЖДЕНИЕ

Функция генов

Потеря функции PHAN в A. majus привела к абаксиализации листьев (Waites et al., 1998). Однако мутанты Arabidopsis as1 и кукурузы rs2 не обнаруживали явных дефектов полярности листьев (Schneeberger et al., 1998; Serrano-Cartagena et al., 1999). Более того, у видов со сложными листьями наблюдали различную структуру листьев, когда подавлялись ARP ортологов.Подавление ARP в томатах приводит к изменению количества и формы листочков (Kim et al., 2003a). Мутация AS1 в C. hirsuta привела к увеличению количества листочков за счет развития дополнительных листочков (Hay and Tsiantis, 2006). У мутанта гороха cri развиваются абаксиальные листочки и эктопические прилистники, и они оказывают лишь незначительное влияние на сложность листьев (Tattersall et al., 2005). У M. truncatula длина рахиса у мутанта phan была аналогична длине рахиса дикого типа, хотя листья с более длинным позвоночником наблюдались на некоторых узлах у мутанта phan (Ge et al., 2014). Наиболее очевидными дефектами, обнаруженными у мутанта phan , были узкие пластинки и укороченные черешки, которые были аналогичны дефектам у мутанта cri . Следует отметить, что вставка Tnt1 расположена на 3′-конце кодирующей последовательности PHAN , и 9% -ная экспрессия PHAN , обнаруженная у мутанта, может приводить к некоторой остаточной функции. Хотя и M. truncatula , и горох являются членами IRLC, сложность их листьев различна. M. truncatula имеет простейшую сложную форму листа, состоящую только из трех листочков с одинаковой идентичностью, в то время как горох имеет более сложную форму листа, включающую узкоспециализированные усики. Даже в этом случае ни количество листовок, ни их идентичность не изменились у мутантов phan и cri независимо от сложности их листа. Согласно этим наблюдениям, ортологи PHAN могут играть ограниченную роль в формировании сложных листьев у видов IRLC.Более того, увеличение активности ARP привело к различному фенотипическому результату у разных видов. Сверхэкспрессия AS1 в Arabidopsis или PHAN в M. truncatula не изменяла сложность листа, такую ​​как повторение долей или листочков (Theodoris et al., 2003). Однако эктопическая экспрессия PHAN в томатах продуцирует эктопический адаксиальный домен в листьях, что приводит к дефектам формирования рисунка листьев. Таким образом, эти наблюдения подразумевают, что ARPs функционируют видоспецифическим образом во время развития листа.Мы провели сравнительный анализ и суммировали паттернов экспрессии ARP среди видов (дополнительный рисунок 13).

Хотя горох является членом IRLC, а Lotus japonicus — нет, паттерны экспрессии CRI и Lj- PHANa / b аналогичны. Их транскрипты были обнаружены в сайтах инициации листа (P0), но исключены из SAM, образуя взаимоисключающий паттерн с генами KNOXI . К нашему удивлению, M. truncatula PHAN имеет отчетливый паттерн экспрессии по сравнению с таковым у Arabidopsis , C.hirsute и другие виды бобовых (Byrne et al., 2000; Luo et al., 2005; Tattersall et al., 2005; Hay and Tsiantis, 2006) (дополнительный рисунок 13). M. truncatula PHAN диффузно экспрессируется по всему SAM, показывая перекрывающийся домен экспрессии с генами KNOXI . Распространенная экспрессия M. truncatula PHAN в SAM сходна с таковой у томатов и явно отличается от таковой в горохе, хотя M. truncatula и горох эволюционно близки друг к другу.С другой стороны, доменов экспрессии ARP ассоциированы с адаксиальной стороной зачатков листьев на ранних стадиях развития у видов со сложными листьями. Например, PHAN показал адаксиальную экспрессию в зачатках листьев P3 / P4 томата (Kim et al., 2003a, 2003b), P1 L. japonicus (Luo et al., 2005) и P3 гороха ( Tattersall et al., 2005) (дополнительный рисунок 13). У M. truncatula было обнаружено транскриптов PHAN как на адаксиальной, так и на абаксиальной сторонах зачатков листа от P1 до P5.Однако мРНК PHAN была ограничена адаксиальной стороной листа на поздней стадии развития (P6 / P7). Адаксиальная экспрессия PHAN во время развития листа предполагает, что он может играть роль в поддержании полярности листа, о чем свидетельствует частично абаксиальный лист и повышенная регуляция экспрессии YABBY в мутанте phan . Взятые вместе, эти результаты предполагают, что роли ортологов ARP варьируются в зависимости от вида, что приводит к различным эффектам развития у разных видов.

В Arabidopsis , STM репрессирует экспрессию AS1 в SAM, а мутант as1 может спасти фенотип stm (Byrne et al., 2000). Аналогичная регуляторная взаимосвязь была также обнаружена у томатов, где Le- T6 является негативным регулятором PHAN (Kim et al., 2003b). Более того, PHAN отрицательно регулирует STM в A.majus (Tsiantis et al., 1999) и BP ортологов у Arabidopsis , C. hirsuta , томата и гороха (Kim et al., 2003b; Tattersall et al., 2005; Hay and Tsiantis, 2006 ; Guo et al., 2008). В этом исследовании мы исследовали взаимосвязь между PHAN и STM / BP-подобными генами KNOXI в M. truncatula . Неожиданно наши результаты предоставляют доказательства, которые опровергают консервативную связь между PHAN и STM / BP-подобными генами KNOXI , о которых сообщалось ранее.Во-первых, уровень и паттерн экспрессии PHAN не изменились у одиночных и множественных мутантов как STM-подобных генов , так и BP-подобных генов KNOXI . Точно так же уровни экспрессии STM / BP-подобных генов KNOXI также не показали значительных изменений у мутанта phan . В другом сообщении STM / BP-подобных генов KNOXI были слегка усилены (<2-кратно) в зачатках побегов мутанта phan (Ge et al., 2014). Однако такое увеличение экспрессии KNOXI в phan несопоставимо с усилением экспрессии BP в as1 (> 100 раз) (Hay et al., 2006). Во-вторых, генетические данные показали, что нокаут STM / BP-подобных генов KNOXI не смог спасти фенотип phan . Эти результаты вместе показывают, что маловероятно, что консервативная регуляторная цепь между PHAN и STM / BP-подобными генами KNOXI существует в M. truncatula . Кроме того, в предыдущих исследованиях сообщалось, что экспрессия BP подавляется с помощью PIN1 -опосредованного транспорта ауксина в Arabidopsis .Потеря активности BP частично устраняет дефекты в мутанте pin1 (Hay and Tsiantis, 2006). Однако в M. truncatula нарушение активности SLM1 не привело к эктопической экспрессии гена KNOXI , подобного п.н. Более того, нокаут любого или всех STM / BP-подобных генов KNOXI не смог устранить дефекты развития цветов и производства семян у мутанта slm1 . В целом, наши данные подтверждают, что STM / BP-подобных генов KNOXI не связаны с PHAN .

Подавление роста вдоль проксимально-дистальной оси наблюдалось у мутантов arp у нескольких видов, и этот признак был связан с эктопической экспрессией генов KNOXI (Tattersall et al., 2005; Hay et al., 2006; Хэй, Циантис, 2006). В Arabidopsis , KNAT2 и KNAT6 находятся под отрицательной регуляцией AS1 (Byrne et al., 2000; Ori et al., 2000; Semiarti et al., 2001; Guo et al., 2008). . Наши данные также показали, что KNAT2 / 6-подобный ген класса I KNOX7 активируется в черешке мутанта phan , предполагая, что эктопическая экспрессия KNOX7 может вносить вклад в фенотип phan .Экспрессия KNOX8 остается по существу неизменной между диким типом и phan , что указывает на то, что KNOX8 может не быть связан с PHAN . Домен экспрессии KNOX7 перекрывается с доменом PHAN в SAM, хотя KNOX7 репрессируется в зародышевых зачатках листа. Сходное перекрытие между PHAN и TKN1 наблюдалось в SAM томатов (Kim et al., 2003b). Это наблюдение подразумевает, что другие гены могут участвовать в репрессии KNOX7 , и механизм регуляции KNOX7 не универсален в разных доменах развития.Было высказано предположение, что гены KNOXI играют избыточную роль в поддержании SAM у Arabidopsis (Byrne et al., 2002; Belles-Boix et al., 2006), риса (Tsuda et al., 2011) и кукурузы ( Bolduc et al., 2013). В этом исследовании одновременное разрушение трех STM / BP-подобных генов KNOXI не влияло на функцию SAM в M. truncatula . Следовательно, будущая идентификация мутантов с потерей функции KNAT2 / 6-подобных генов KNOXI поможет прояснить (1), функционируют ли STM / BP-подобных генов KNOXI и KNAT2 / 6-подобных генов KNOXI избыточно в Обслуживание ЗРК; (2) являются ли KNAT2 / 6-подобных генов KNOXI репрессорами PHAN ; и (3) как процесс развития сложных листьев в IRLC смещается от механизма регуляции, опосредованного семейством генов KNOXI .

Для создания конструкции PHAN _RNAi фрагмент PHAN длиной 390 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из M. truncatula дикого типа и клонировали в вектор клонирования pENTR / D-TOPO (Invitrogen), затем переносили в вектор pANDA35K реакциями рекомбинации attL × attR (Invitrogen).Чтобы получить конструкцию комплементации, последовательность промотора PHAN длиной 2611 п.н. плюс кодирующая последовательность PHAN длиной 1080 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в вектор pHGWFS7 (Karimi et al., 2002). Для создания конструкции PHANpro: GUS промоторная область PHAN длиной 2611 п.н. была амплифицирована и перенесена в вектор pHGWFS7 (Karimi et al., 2002) для анализа паттерна экспрессии гена. Для сверхэкспрессии PHAN , KNOX1 , KNOX2 , KNOX4 , KNOX6 и SGL1 CDS этих генов были амплифицированы и клонированы в вектор pEarleyGate al 100 (EarleyGate al 100., 2006) соответственно. Последовательности праймеров перечислены в дополнительной таблице 3.

Стабильная трансформация растений

вводили в обезвреженную Agrobacterium tumefaciens , используя метод замораживания / теплового шока. Штамм EHA105 Agrobacterium , несущий различные векторы, использовали для трансформации M. truncatula , как описано (Cosson et al., 2006). Количество трансгенных линий указано в дополнительной таблице 2.

Анализ окрашивания и сканирующей электронной микроскопии GUS

GUS были обнаружены гистохимически, как описано ранее (Zhou et al., 2011). Для сканирующей электронной микроскопии образцы ткани листа сначала фиксировали в фиксирующем растворе (3% глутарового альдегида в 25 мМ фосфатном буфере, pH 7,0) в течение ночи, обезвоживали в сериях градуированных этанолов, а затем сушили до критической точки. Растровый электронный микроскоп Hitachi TM-3000 использовался для наблюдения образцов при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Экстракция РНК, ОТ-ПЦР, анализ ПЦР в реальном времени и статистический анализ

Суммарную РНК из различных органов, таких как лист, черешок и верхушки побега, экстрагировали из 4-недельных растений. ОТ-ПЦР и анализ ПЦР в реальном времени выполняли, как описано ранее (Zhou et al., 2012). Однофакторный метод ANOVA использовался для оценки значимости разницы при анализе уровня экспрессии генов и фенотипа растений.

Гибридизация РНК in situ

Фрагменты размером 752, 587, 632, 681 и 777 п.н. были выделены из CDS PHAN , KNOX1 , KNOX2 , KNOX6 и KNOX7 соответственно.Продукты ПЦР метили дигоксигенином. Гибридизацию РНК in situ проводили на верхушках побегов 6-недельных растений, как описано ранее (Zhou et al., 2011).

Филогенетический анализ

Выравнивание множественных последовательностей выполняли с использованием ClustalW2 с параметрами по умолчанию (тип выравнивания, медленное; матрица веса белка, gonnet; Gap open, 10; Gap extension, 0,1). Филогенетическое дерево соединения соседей было построено с использованием пакета программ MEGA 6 (http: // www.megasoftware.net/). Были показаны самые экономные деревья со значениями бутстрапа из 1000 испытаний.

Регистрационный номер

Данные последовательности из этой статьи можно найти в Национальном центре биотехнологической информации GenBank под следующими номерами доступа: KNOX1, Medtr2g024390; KNOX2, Medtr1g017080; KNOX3, Medtr1g012960; KNOX4, Medtr5g011070; KNOX5, Medtr3g106400; KNOX6, Medtr5g085860; KNOX7, Medtr5g033720; KNOX8, Medtr1g084060; KNOX9, Medtr4g116545; KNOX10, Medtr2g461240; Mt-PHAN, Medtr7g061550; PHAN, CAA06612; CRI, AAG10600.1; GM-PHANa, NP_001236839.1; GM-PHANb, NP_001235251.1; Lj-PHANa, AAX21343.1; Lj-PHANb, AAX21344.1; АС1, НП_181299.1; и Ch-AS1, ABF59515.1.

Дополнительные данные

В онлайн-версии статьи доступны следующие материалы.

Благодарности

Благодарим Джеки Келли и Эми Мейсон за критическое прочтение статьи. Мы благодарим Kirankumar Mysore и Million Tadege за предоставление мутантов Tnt1 ; Ын Сок Джо за помощь в выделении ДНК, культуре тканей и уходе за растениями; Джин Накашима за анатомический анализ; и Туи Рэй и Стейси Аллен для анализа ПЦР в реальном времени.Благодарим персонал теплицы за помощь в выращивании растений. Эта работа была поддержана Благородным фондом Сэмюэля Робертса, Научным центром биоэнергетики и Китайским фондом естественных наук (31371235). Научный центр биоэнергетики — это исследовательский центр биоэнергетики Министерства энергетики США, поддерживаемый Управлением биологических и экологических исследований Управления науки Министерства энергетики США.

Глоссарий

• SAM

• CK

• IRLC

  инвертированная кладка без повторяющихся элементов

• CDS

• qRT-PCR

С.З. и З.-Й.В. разработал исследование. C.Z., L.H., G.L., M.C., C.F. и X.C. проводил эксперименты. C.Z., L.H., G.L., M.C., C.F. и X.C. проанализировали данные. J.W. и Ю. предоставил аналитические инструменты. C.Z. и Z.-Y.W. написал статью.

Список литературы

(

2008

Каркас развития рассеченного листа у родственника Arabidopsis Cardamine hirsuta

Нац. Genet.

40

1136

1141

(

2006

KNAT6: ген гомеобокса Arabidopsis, участвующий в активности меристемы и разделении органов

Plant Cell

18

1900

1907

(

2002

Гомологии в форме листа, полученные из экспрессии гена KNOXI во время развития

Наука

296

1858

1860

(

2009

Фактор транскрипции кукурузы KNOTTED1 напрямую регулирует ген катаболизма гиббереллина ga2ox1

Plant Cell

21

1647

1658

Болдук, Н., Тайерс, Р., Фрилинг, М., и Хейк, С. (2014). Неравная избыточность в генах гомеобокса узловатой кукурузы1. Plant Physiol. 164: 229–238.

(

2000

Асимметричные листья1 опосредуют формирование рисунка листа и функцию стволовых клеток у Arabidopsis

Природа

408

967

971

(

2002

ASYMMETRIC LEAVES1 выявляет избыточность гена knox у Arabidopsis

Девелопмент

129

1957

1965

(

2007

Развитие сложных листьев и эволюция бобовых

Plant Cell

19

3369

3378

(

2006

Трансформация Medicago truncatula с использованием листовых эксплантатов

Methods Mol. Биол.

343

115

127

(

2008

Характеристика генов KNOX в Medicago truncatula

Завод Мол. Биол.

67

135

150

(

2006

Векторы, совместимые со шлюзом для функциональной геномики и протеомики растений

Plant J.

45

616

629

(

2014

Регулирование развития сложного листа с помощью PHANTASTICA в Medicago truncatula

Plant Physiol.

164

216

228

(

2008

Прямая репрессия локусов KNOX комплексом ASYMMETRIC LEAVES1 Arabidopsis

Plant Cell

20

48

58

(

2004

Роль knox-генов в развитии растений

Annu. Rev. Cell Dev. Биол.

20

125

151

(

1996

Создание составного листа: генетические манипуляции с архитектурой листа томата

Ячейка

84

735

744

(

2006

Генетическая основа различий в форме листа между Arabidopsis thaliana и его диким родственником Cardamine hirsuta

Нац. Genet.

38

942

947

(

2010

Гены KNOX: универсальные регуляторы развития и разнообразия растений

Девелопмент

137

3153

3165

(

2006

ASYMMETRIC LEAVES1 и активность ауксина сходятся, чтобы подавить экспрессию BREVIPEDICELLUS и способствовать развитию листьев у Arabidopsis

Девелопмент

133

3955

3961

(

2001

Экспрессия гена гомеобокса типа knotted1 класса 1 подавляется в зачатках сложных листьев гороха

Завод Мол. Биол.

45

387

398

(

1997

UNIFOLIATA регулирует морфогенез листьев и цветов гороха

Curr. Биол.

7

581

587

(

1995

Параллели между НЕОБЫЧНЫМИ ЦВЕТОЧНЫМИ ОРГАНАМИ и FIMBRIATA, генами, контролирующими развитие цветков у Arabidopsis и Antirrhinum

Plant Cell

7

1501

1510

(

2005

Действие KNOX у Arabidopsis опосредуется координационной регуляцией активности цитокининов и гиббереллинов

Curr. Биол.

15

1560

1565

(

2002

GATEWAY векторы для опосредованной Agrobacterium трансформации растений

Trends Plant Sci.

7

193

195

(

2003

Домен экспрессии PHANTASTICA определяет размещение листка в составных листьях

Природа

424

438

443

(

2003

Пониженная сложность листьев у жилистых мутантов томатов предполагает роль генов PHAN и KNOX в образовании сложных листьев

Девелопмент

130

4405

4415

(

1997

Корегулятор LEAFY, кодируемый НЕОБЫЧНЫМИ ЦВЕТОЧНЫМИ ОРГАНАМИ

Curr. Биол.

7

95

104

(

1994

Узловатый1-подобный ген гомеобокса у Arabidopsis экспрессируется в вегетативной меристеме и резко изменяет морфологию листа при сверхэкспрессии в трансгенных растениях

Plant Cell

6

1859

1876

(

2013

Комплекс ASYMMETRIC LEAVES поддерживает репрессию генов гомеобокса KNOX посредством прямого рекрутирования Polycomb-репрессивного комплекса2

Genes Dev.

27

596

601

(

1996

Член класса гомеодоменных белков KNOTTED, кодируемых геном STM Arabidopsis

Природа

379

66

69

(

2005

Различные паттерны экспрессии дублированных PHANTASTICA-подобных генов в Lotus japonicus предполагают их дивергентные функции во время развития сложного листа

Cell Res.

15

665

677

(

2009

Влияние генов MULTIFOLIATE-PINNA, AFILA, TENDRIL-LESS и UNIFOLIATA на архитектуру листовых пластинок у Pisum sativum

Planta

230

177

190

(

2011

Как лист получает свою форму

Curr. Opin. Plant Biol.

14

24

30

(

2000

Механизмы, контролирующие экспрессию гена knox в побегах Arabidopsis

Девелопмент

127

5523

5532

(

2008

Взаимодействие KNAT6 и KNAT2 с BREVIPEDICELLUS и PENNYWISE в соцветиях Arabidopsis

Plant Cell

20

888

900

(

2001

KNOX напрямую подавляет экспрессию гена биосинтеза гиббереллина в апикальной меристеме

Genes Dev.

15

581

590

(

1998

Ген грубого кожуха3 отрицательно регулирует экспрессию гена гомеобокса во время развития листьев кукурузы

Девелопмент

125

2857

2865

(

2001

Ген ASYMMETRIC LEAVES2 Arabidopsis thaliana регулирует формирование симметричной пластинки, установление жилкования и репрессию генов гомеобокса, связанных с меристемой, в листьях

Девелопмент

128

1771

1783

(

1997

Локализация экспрессии KNAT3, гена типа knotted1 класса 2

Plant J.

11

853

861

(

1999

Генетический анализ мутантов листовой формы из коллекции Информационной службы Arabidopsis

Мол. Genet Genet.

261

725

739

(

2009

Стадия-специфическая регуляция созревания листьев Solanum lycopersicum белками KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX класса 1

Plant Cell

21

3078

3092

(

2008

Крупномасштабный инсерционный мутагенез с использованием ретротранспозона Tnt1 в модельной бобовой Medicago truncatula

Plant J.

54

335

347

(

2005

Мутант crispa обнаруживает множественные роли PHANTASTICA в развитии сложных листьев гороха

Plant Cell

17

1046

1060

(

2001

Stamina pistilloida, ортолог гороха Fim и UFO, необходим для нормального развития цветов, соцветий и листьев

Plant Cell

13

31

46

(

2003

Консервация и молекулярное рассечение ROUGH SHEATh3 и ASYMMETRIC LEAVES1 функционируют в развитии листьев

Proc. Natl. Акад. Sci. США

100

6837

6842

(

1999

ROUGH SHEATh3: белок Myb, который репрессирует гены knox-гомеобокса в зачатках боковых органов кукурузы

Наука

284

151

153

(

2012

Новое развитие: эволюция концепций в онтогенезе листа

Annu. Rev. Plant Biol.

63

535

562

(

1999

Программы развития гена грубой оболочки3 и листьев кукурузы у однодольных и двудольных растений

Наука

284

154

156

(

2011

Положительная ауторегуляция гена KNOX важна для поддержания апикальной меристемы побегов у риса

Plant Cell

23

4368

4381

(

2002

Ген гомеобокса BREVIPEDICELLUS является ключевым регулятором архитектуры соцветий Arabidopsis

Proc. Natl. Акад. Sci. США

99

4730

4735

(

1991

Ген развития Knotted-1 является членом семейства генов гомеобокса кукурузы

Природа

350

241

243

(

1998

Ген PHANTASTICA кодирует фактор транскрипции MYB, участвующий в росте и дорсовентральности боковых органов Antirrhinum

Ячейка

93

779

789

(

2008

Контроль развития сложных листьев с помощью ортолога FLORICAULA / LEAFY SINGLE LEAFLET1 в Medicago truncatula

Plant Physiol.

146

1759

1772

(

2004

Филогения бобовых (Leguminosae), основанная на анализе пластидного гена matK, разрешает многие хорошо поддерживаемые субклады в семействе

г. J. Bot.

91

1846

1862

(

2005

Белки KNOXI Arabidopsis активируют биосинтез цитокининов

Curr. Биол.

15

1566

1571

(

2012

Идентификация и характеристика петиолулеподобных мутантов pulvinus с устраненным никтинастным движением листьев в модельном бобовом Medicago truncatula

New Phytol.

196

92

100

(

2011

Анализ развития мутанта с гладким краем листа Medicago truncatula1 выявил контекстно-зависимые эффекты на развитие сложного листа

Plant Cell

23

2106

2124

(

2012

Роль PHANTASTICA в медиолатеральной регуляции развития адаксиальных доменов в листьях томатов и табака

Ann. Бот. (Лондон)

109

407

418

Заметки автора

© 2014 Американское общество биологов растений. Все права защищены.

© Автор (ы) 2014. Опубликовано Oxford University Press от имени Американского общества биологов растений. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (https: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /), что разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Формирование дорсовентрального паттерна у растений

Хотя мутации, влияющие на формирование дорсовентрального паттерна у растений, были известны веками (Linnaeus 1749), лежащие в основе механизмы, контролирующие этот процесс, остаются загадочными. Недавние статьи Sawa et al. (1999b) и другие начали проливать свет на этот вопрос путем выделения и характеристики генов, ответственных за дорсовентральность.У растений боковые органы и побеги начинаются с боков апикальной меристемы побега (АМ), многослойного купола. самоорганизующихся и самовоспроизводящихся ячеек. Primordia выходят из SAM с характерной асимметрией и идентичностью. которые зависят как от внешних, так и от внутренних факторов (рис.). Для листовых зачатков это означает наличие четко выраженных верхних и нижних частей. программы роста и клеточной дифференциации, так что клетки в верхней половине развивают соответствующий эпидермис, палисад мезофилл, нить ксилемы и клетки в нижней половине образуют нить флоэмы, губчатый мезофилл и соответствующий эпидермис.Различия в форме органов и типах клеток между адаксиальной (верхней) и абаксиальной (нижней) сторонами зрелого листа гарантируют, что растение направляет большую часть своей светособирающей способности на свет.

Продольный срез верхушки побега Arabidopsis , показывающий SAM и молодой зачаток листа с указанными абаксиальной и адаксиальной сторонами и показывающий экспрессию FIL (коричневая окраска) на абаксиальной стороне зачатка молодого листа (изображение любезно предоставлено Джоном Боуменом).Ранняя литература определяет абаксиальную поверхность как дорсальную, тогда как более недавнее использование в литературе относится к адаксиальной поверхности как к дорсальной. Чтобы не было путаницы, в этом обзоре мы используем термины абаксиальный и адаксиальный.

Асимметрия формы большинства листьев очевидна с самого начала, поскольку они появляются в виде полумесяца на боковой стороне SAM, и эта дорсовентральность дополнительно усиливается за счет различного роста адаксиальной и абаксиальной сторон.Ранняя асимметрия также обнаруживается адаксиально- и абаксиально-специфической экспрессией генов в зародышевых и молодых зачатках органов (рис. Sawa et al. 1996). Формирование дорсовентрального паттерна также происходит в боковых зачатках, которые дают асимметричные побеги, такие как цветок львиного зева, у которого различаются верхнее и нижнее расположение лепестков и тычинок. Дорсовентральность этого и других асимметричные боковые побеги — результат различий в зарождении и росте органов на адаксиальном и абаксиальном сторонам бокового ЗРК, а также к асимметрии самого бокового ЗРК.

Как это делают мухи?

Проблема формирования дорсовентрального паттерна придатков лучше всего понятна в развивающемся крыле Drosophila (см. Обзор Brook et al. 1996; Lawrence and Struhl 1996). Процесс начинается, когда крыловой имагинальный диск формируется как инвагинация эмбриональной эктодермы (для обзора см. Cohen 1993). Затем крыловой диск подразделяется на отсеки дорсальной и вентральной ветвей.Первичный ген, участвующий в определении Идентичность дорсальных клеток составляет apterous ( ap ), который экспрессируется в дорсальных, но не вентральных клетках (Cohen et al. 1992; Diaz-Benjumea and Cohen 1993; Blair et al. 1994). ap затем определяет дорсальную идентичность и направляет экспрессию ряда других генов, ведущих к активации экспрессии wingless ( wg ) вдоль дорсовентральной границы (Irvine and Wieschaus 1994; Diaz-Benjumea and Cohen 1995; Kim et al. .1995; Рулифсон и Блэр, 1995 г .; ДеСелис и др. 1996; Нойман и Коэн 1996). Wg представляет собой секретируемый белок, который действует как морфоген, определяющий судьбы дорсальных и вентральных клеток в развивающемся крыле (Zecca et al. 1996; Neuman and Cohen 1997). Сопоставление дорсальных и вентральных клеток индуцирует экспрессию wg и образование организующего центра на краю, что приводит к разрастанию крыла (Blair et al. 1994; Williams et al. 1994).

На основании этих и других исследований было высказано предположение, что результатом могут быть многие аспекты формирования паттерна у развивающихся животных. подобной парадигмы развития, начиная с создания доменов или компартментов.Впоследствии ближний передача сигналов через границу двух доменов в конечном итоге приводит к образованию диффузной сигнальной молекулы с большим радиусом действия. это определяет паттерн как морфоген из пограничного положения (Lawrence and Struhl 1996).

Классические исследования формирования дорсовентрального паттерна у растений

Ранние работы указали на важность SAM в передаче сигналов только что инициированным зачаткам на его флангах.Хирургический надрезы, которые отделяли зарождающиеся зачатки листьев от родительского SAM, привели к их развитию в виде радиальных листьев, или центральные органы, которым не хватало четких адаксиальных и абаксиальных идентичностей (Sussex 1955; Snow and Snow 1959; Hanawa 1961). Эти и другие результаты привели к предположению, что SAM посылает сигнал ингибирования роста адаксиальной поверхности листа. primordia, что приводит к асимметричному росту и возникновению дорсовентральности (Wardlaw 1949).Однако другие эксперименты, документирующие развитие дорсовентральных листьев в отсутствие SAM, не подтверждают это. гипотеза (обсуждается в Steeves and Sussex 1989). В одном отчете предполагалось, что асимметричное влияние силы тяжести было ответственно за формирование дорсовентрального паттерна у животных. некоторые цветы, так как растения с обычно асимметричными цветками образовывали симметричные цветки при выращивании в клиностате (Vöchting 1884).

Асимметрично выраженные факторы

Более недавние открытия дорсовентрального паттерна у растений пришли, как и в случае с мухами, в виде мутантов, которые имеют фенотипы развития, которые вызывают образование адаксиальных тканей вместо абаксиальных и наоборот.Первые подсказки пришли с характеристикой генов CYCLOIDEA ( CYC ) и DICHOTOMA ( DICH ) из львиного зева (Luo et al. 1996). Львиный зев подобен многим растениям с асимметричными цветками, а двойные мутанты cyc dich дают абаксиализированные цветки, которые радиально симметричны (Coen 1996; Luo et al. 1996). CYC и DICH кодируют близкородственные белки, что согласуется с генетическими данными, предполагающими избыточность, и сходны с другим регулятором. бокового разрастания растений продукт кукурузы TEOSINTE BRANCHED1 ( TB1 ) (Doebley et al.1997). Гомология между CYC и TB1 включает 62-аминокислотную область, содержащую предполагаемый сигнал ядерной локализации, что позволяет предположить, что эти белки могут функционировать в качестве регуляторов транскрипции (Doebley et al. 1997). CYC экспрессируется в адаксиальной половине цветочного зачатка и в адаксиально расположенных зачатках цветочного органа, где он контролирует скорость роста и зарождение зачатков (Luo et al. 1996). Развитие абаксиальных идентичностей вместо адаксиальных у двойных мутантов cyc dich указывает на то, что CYC / DICH действуют, чтобы подавлять развитие абаксиальных идентичностей на адаксиальной стороне зачатка цветка.Интересно, что активность продукта гена DIVARICATA из львиного зева, по-видимому, необходим для абаксиальной идентичности и ограничен абаксиальной частью зачатка за счет антагонистической активности CYC и DICH (Almeida et al. 1997).

Симметрично выраженные множители

Ключи к формированию дорсовентрального паттерна во время развития листа пришли с выделением гена львиный зев PHANTASTICA ( PHAN ) (Waites et al.1988). phan мутанты имеют игольчатые абаксиализированные листья и лепестки, которые в значительной степени лишены адаксиальных структур и пластинок (Waites and Hudson 1995). Ранние листья имеют участки абаксиальной ткани на адаксиальной поверхности и там, где два типа клеток встречаются с эктопическими краями листа. форма. Абаксиальные игольчатые листья без пластинок, а также эктопические пластинки, окружающие участки абаксиальных клеток. на адаксиальной поверхности ранних листьев у мутантов phan , оба убедительно предполагают, что сопоставление адаксиальной и абаксиальной идентичностей может привести к индукции пластинки нарост.Эксперименты по температурному сдвигу показывают, что PHAN необходим только для дорсовентральности перед появлением примордия, предполагая, что это указано в SAM, как предполагается. с помощью более ранних хирургических экспериментов (Waites et al. 1988). PHAN кодирует фактор транскрипции, связанный с MYB, который экспрессируется во всех клетках всех зачатков боковых органов, инициированных из побега. и цветочные меристемы (Waites et al. 1988). Поскольку абаксиализированные фенотипы встречаются только в подмножестве латеральных органов мутантов phan , наблюдаемый паттерн экспрессии подразумевает, что другие факторы модулируют активность PHAN .

Итак, статьи Sawa et al. (1999b) и Bowman and Smyth (1999) сообщают о существовании семейства генов, которое потенциально контролирует формирование абаксиального паттерна у Arabidopsis . В статье Sawa et al. в этом выпуске описывается выделение и паттерн экспрессии гена FILAMENTOUS FLOWER ( FIL ) (Sawa et al.1999b). fil мутанты обладают плейотропными дефектами в инициации и развитии как меристем цветка, так и органов цветка (Sawa et al. 1999a). Мутанты fil производят два типа аберрантных цветков, которые расположены в трех зонах вдоль стебля соцветия. Первые 10–15 полученные цветы имеют деформированную форму, неправильное расположение или отсутствие органов. Далее следует производство ∼20 узлами нитевидных структур и, наконец, зоной обоих типов структур.Нити-подобные структуры кажутся частичные цветки, состоящие только из базальной ножки, без дистального цветоложа или части цветка, несущей орган (Сава и др., 1999a). Общей чертой двух типов аберрантных цветов является отсутствие полного набора цветочных органов.

Фенотипы одиночных мутантов fil могут обеспечить только частичную картину функции FIL , однако, поскольку FIL является членом мультигенного семейства в Arabidopsis , которое включает близкородственных членов.Ключ к разгадке функции FIL , не очевидной для фенотипа с одним мутантом fil , взят из исследований экспрессии, показывающих, что РНК FIL обычно накапливается только на абаксиальной стороне листьев, цветочных меристем и всех цветковых органов (Sawa et al. . 1999b). Более того, когда ген FIL экспрессируется эктопически, листья развиваются либо в виде заблокированных цилиндрических структур, которые не могут инициировать пластинку. отростка или в виде морщинистых органов, на адаксиальной поверхности которых образуются участки абаксиальных эпидермальных клеток (Sawa et al.1999b). Взятые вместе, эти результаты предполагают, что нормальная роль FIL может включать стимулирование судьбы абаксиальных клеток. Это может частично объяснить фенотипы цветков мутантов fil , если во время нормального развития необходимо взаимодействие между абаксиальными и адаксиальными типами клеток в молодом цветочном зачатке. чтобы вызвать формирование сосуда.

FIL связан с недавно выделенным геном CRABSCLAW ( CRC ), мутации которого приводят к дефектам плейотропного роста в развивающемся гинецеи и цветочной меристеме (Alvarez and Smyth 1999; Bowman and Smyth 1999). CRC также демонстрирует сложный паттерн экспрессии в развивающемся гинецее, который включает абаксиальный домен, подобный, но отличающийся из FIL (Bowman and Smyth 1999). Подобно fil , интерпретация мутантных фенотипов crc может быть затруднена присутствием повторяющихся генов. С этой идеей согласуется наблюдение, что Было показано, что мутации в нескольких генах синергетически усиливают фенотип crc gynoecium, что приводит к развитию нормально адаксиальных плацент на абаксиальной поверхности (Bowman et al.1999; Ю. Эшед и Дж. Боуман, личн. комм.). Эти данные предполагают, что по крайней мере одна из функций CRC состоит в том, чтобы способствовать судьбе абаксиальных клеток во время развития гинецея, хотя одиночные мутанты crc не предполагают этого.

И FIL , и CRC принадлежат к семейству генов в Arabidopsis , которое также включает по крайней мере четыре других члена (Bowman and Smyth 1999; Sawa et al. 1999b).Все эти гены кодируют спираль-петлю-спираль / HMG-подобную область, называемую доменом YABBY, а также цинковый палец. домен (Bowman and Smyth, 1999). Близкое сходство последовательностей, присущее членам этого семейства генов, может частично объяснять выявленную очевидную избыточность. в генетических исследованиях и исследованиях экспрессии. Например, FIL тесно связан с YAB3, так как эти два белка идентичны на 98% в домен YABBY и на 75% идентичен в области цинкового пальца, указывая тем самым, что YAB3 может быть избыточным партнером для FIL (Bowman and Smyth 1999).

Другой интересный представитель семейства генов YABBY , который был недавно охарактеризован, — это ген INNER NO OUTER ( INO ), который необходим для нормального развития яйцеклетки (C. Gasser, J. Villanueva и K. Schneitz, чел. комм.). Мутации в INO приводят к потере внешнего покрова, структуры, которая обычно формируется на абаксиальной стороне зачатка семяпочки (Baker et al. 1997).Таким образом, появляется общая тема для ролей по крайней мере трех членов класса предполагаемой транскрипции YABBY. Факторы, поскольку все они, по-видимому, действуют, чтобы способствовать абаксиальной идентичности органов, в которых они выражены.

Мутанты, ожидающие клонирования

Сообщалось также о других мутантах, которые проявляют фенотип полярности, подобный упомянутым выше. leafbladeless1 ( lbl1 ) мутанты кукурузы имеют радиально-симметричные листья, которые абаксиализированы, подобно мутантам phan у львиного зева (Timmermans et al. 1998). lbl1 мутанты также образуют листья с участками абаксиального эпидермиса на адаксиальной поверхности, которые производят ламинарные выросты на эктопические адаксиально-абаксиальные границы (Timmermans et al. 1998). Эктопические пластинки обычно встречаются парами по бокам абаксиального участка ткани, проходящего по длине средней жилки на адаксиальная поверхность.Предполагается, что эктопические пластинки возникают из-за сопоставления адаксиальной и абаксиальной территорий, аналогично предложению для мутантов phan . В отличие от мутантов phan поражены все боковые органы растений lbl1 . Интересно, что мутанты lbl1 обнаруживают дефекты в привлечении клеток-основателей листа, поскольку меньшее количество клеток, чем у мутантов дикого типа, демонстрирует понижающую регуляцию маркера. для идентификации нелистовых основателей в SAM (Timmermans et al.1998). Хотя мутанты lbl1 и phan имеют много общего, LBL1 не является ортологом кукурузы для PHAN (Timmermans et al. 1998).

В отличие от рецессивных мутантов lbl и phan , доминантная мутация phabulosa-1d ( phb-1d ) в Arabidopsis обусловливает адаксиализацию листьев и развитие пазушных зачатков у абаксиального основания. мутантных листьев (McConnell and Barton 1998). phb-1d листья либо игольчатые и лишены абаксиальных особенностей, либо имеют форму трубы. Форма трубы кажется результатом от дублированной проксимодистальной оси с перевернутой адаксиально-абаксиальной полярностью, формирующейся на абаксиальном основании органа. Похожий до lbl1 мутация phb-1d затрагивает все надземные боковые органы растения (McConnell and Barton 1998).

Перспективы на будущее

Теперь, когда доступна большая коллекция мутантов и асимметрично выраженных маркеров, будущее выглядит безоблачным. некоторые из загадок адаксиально-абаксиального паттерна у растений, а также активности уже выделенных факторов.Вылов перед генами CYC и YABBY приведет к подсказкам, определяющим асимметрию в зачатках, тогда как движение вниз по течению от этих и других генов приведет к факторы, которые определяют рост и различия в типах клеток между адаксиальной и абаксиальной. Экраны подавителя и усилителя должны также оказались информативными, поскольку PHAN и YABBY семейств генов подтверждают, что избыточные функции играют значительную роль в формировании абаксиально-адаксиального паттерна.Поднят один вопрос однородным паттерном экспрессии PHAN в зачатках является природа и идентичность других факторов, участвующих в создании асимметричного эффекта этой предполагаемой транскрипции. фактор.

Наконец, несмотря на то, что последний общий предок растений и животных был одноклеточным, примечательное сходство существуют для того, как эти организмы развили механизмы развития, чтобы узор на листьях и крыльях.Эти сходства включают раннее подразделение зачатков органа (и бокового побега) на адаксиальный и абаксиальный домены экспрессии генов, а также совмещение адаксиального и абаксиального доменов для получения латерального роста. Несмотря на эти поразительные сходства, различия между растениями и животными существуют и включают в себя отсутствие клоновых компартментов в растениях (для обзора см. Dawe and Freeling 1991), наличие стенок растительных клеток, которые могут ограничивать способность секретируемых факторов роста распространяться, и различные формы развития и жизненные стратегии растений и животных.Но опять же, если бы листья были крыльями, растения летали бы.

Благодарности

Мы благодарим Джона Боумена, Итана Бир, Детлефа Вайгеля и Медарда Нга за комментарии к рукописи, а также Джона Боумена и Чарльза. Гассеру за разрешение цитировать их неопубликованные результаты. В КАЧЕСТВЕ. поддерживается Фондом исследований в области наук о жизни, и Наши исследования Arabidopsis поддерживаются грантами Национального научного фонда и Национальных институтов здравоохранения (M.Ю.).