Германика ружье: Германика. 12 кал

B. germanica

Материалы и методы

Заявление об этике

Немецкий таракан, использованный в настоящем исследовании, является обычным комнатным насекомым-вредителем, а не исчезающим и охраняемым видом.Не требовалось разрешения для отбора проб и сбора немецких тараканов из зараженных ресторанов, где мы планировали регулярный план наблюдения за плотностью тараканов в целях общественного здравоохранения.

Тараканы

В этом исследовании использовались два штамма немецкого таракана ( B. germanica ) BJ-S и DX-R. Оба штамма содержали раздельно в стеклянных банках одинакового объема (13 литров), покрытых вазелином (верхняя 1/5 часть банки) при температуре 26±1°С и относительной влажности 60±10% с фотопериодом 12∶12 (Л:У) ч. Тараканов кормили кормом для лабораторных грызунов (Beijing Huafukang Biotechnology) и водой без ограничений . Восприимчивый штамм (BJ-S) выращивался в лаборатории без воздействия каких-либо инсектицидов с 1970 года. Полевой штамм (DX-R) был получен из тараканов, собранных в местном ресторане (район Дасин, Пекин) в 2011 году. Сравнение устойчивость двух штаммов к нескольким типам инсектицидов показана в Таблице S1. Включение этой полевой коллекции в данное исследование должно было увеличить генетическое разнообразие и получить предварительную информацию о дифференциально экспрессируемых генах, связанных с устойчивостью к инсектицидам, для будущих исследований.Образцы тараканов для выделения и количественного определения РНК собирали и немедленно замораживали в жидкости N ₂ и хранили при температуре -80°C до использования.

Выделение РНК, создание библиотеки кДНК и 454 пиросеквенирование

Чтобы получить набор транскриптомных данных с максимально широким охватом, РНК экстрагировали из объединенных образцов 30 созревающих оотек, 30 нимф 4 ^{-го возраста} , 30 взрослых самок и 30 взрослых самцов (через 7 дней после вылупления) соответственно из каждый штамм. Суммарную РНК экстрагировали с использованием реагента Trizol (Invitrogen, CA, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Целостность тотальной РНК оценивали с помощью электрофореза в 1,4% денатурирующем формальдегид-агарозном геле и на биоанализаторе Agilent 2100 (Пало-Альто, Калифорния, США) с минимальным значением целостности 8. Количество тотальной РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo , Массачусетс, США). Равные количества (10 мкл) общей РНК (1 мкг/мкл) каждой из четырех жизненных стадий объединяли для формирования пула РНК для каждого штамма.мРНК выделяли с использованием систем выделения мРНК PolyATtract (Promega, WI, USA) из каждого общего пула РНК. Пулы мРНК концентрировали с использованием набора RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Valencia, CA) и использовали в качестве исходного материала для создания библиотеки кДНК.

Две библиотеки кДНК штаммов BJ-S и DX-R были сконструированы отдельно из соответствующих объединенных образцов мРНК для 454 пиросеквенирования. Вкратце, мРНК разбивали на короткие фрагменты в присутствии буфера для фрагментации при 94°C в течение 5 мин.Эти короткие фрагменты использовали в качестве матриц для синтеза первой цепи кДНК с использованием случайных гексамерных праймеров. Затем синтезировали кДНК со второй цепью с использованием dNTP, РНКазы H и ДНК-полимеразы I. Полосы ДНК (500–800 п.н.) вырезали и очищали из агарозных гелей с использованием набора для экстракции из геля QIAquick (Qiagen, Валенсия, Калифорния). Выделенную двухцепочечную кДНК затупляли с помощью ДНК-полимеразы Т4 и полинуклеотидкиназы Т4 (PNK), затем лигировали с адаптерами (Titanium A и B, предоставленными в комплекте библиотеки 454) с помощью ДНК-лигазы Т4 с последующей иммобилизацией на шариках для захвата ДНК.Гранулы для захвата ДНК были клонально амплифицированы с помощью эмульсионной ПЦР (эмПЦР) и обогащены путем удаления отработанного масла из гранул и отбора гранул с амплифицированными фрагментами библиотеки. Гранулы подсчитывали с использованием счетчика частиц Beckman Coulter Z1 и загружали в лунки планшета PicoTiter (PTP). Один полный PTP был секвенирован с половиной планшета для каждой библиотеки в соответствии со стандартными протоколами, описанными Margulies [12] на приборе 454 GS FLX Titanium (Roche Diagnostics, Индианаполис, Индиана).

Предварительная обработка последовательности и сборка

Необработанные 454 прочтения были получены с помощью процесса вызова оснований, который преобразовал измеренные сигналы интенсивности пиролюминесценции в последовательность нуклеотидов.Доступ к ним можно получить через NCBI Short Read Archive (SRA) под кодом доступа SRP042142. Необработанные считывания были предварительно обработаны собственными инструментами TagDust [31] и Seqclean [32] для обрезки адаптера, хвостов поли A/T и удаления низкокачественных, коротких данных считывания и последовательностей загрязнения. Полученные в результате чистые чтения из обоих штаммов соответственно были объединены для сборки в уникальные последовательности с помощью программ ассемблера Newbler [12] с параметрами по умолчанию. Этот проект Transcriptome Shotgun Assembly был депонирован в DDBJ/EMBL/GenBank под регистрационным номером GBID00000000.Версия, описанная в этом документе, является первой версией, GBID01000000.

Поиск гомологии и аннотация EST

Сгенерированные unigenes были сначала подвергнуты поиску BLASTx по базам данных неизбыточных белков Swiss-Prot [33] и NCBI. Последовательности, не извлекающие попадания BLASTx, искали с помощью BLASTn в коллекции нуклеотидов NCBI. Генная онтология (GO), анализ KOG [34] и KEGG [35] использовались для функциональной классификации аннотированных EST. Для анализа онтологии генов использовались как BLAST2GO [36], [37], так и WEGO [38].Программы извлекали термины GO, связанные с гомологиями, идентифицированными с помощью BLAST, и возвращали список аннотаций GO, представленных в виде иерархических категорий с возрастающей специфичностью.

Идентификация и анализ представляющих интерес генов

представляющих интерес гена были дополнительно исследованы вручную для проверки возможных сдвигов рамки, вызванных секвенированием 454 на основе аннотированных EST. Все подтвержденные вручную белковые последовательности использовали для выравнивания и филогенетического анализа.Выравнивания были реализованы с помощью BioEdit и использованы для реконструкции филогении с использованием программного обеспечения MEGA6 [39]. Метод объединения соседей использовался для создания филогенетических деревьев с p-расстоянием при параметрах программы MEGA по умолчанию. Был проведен бутстрап-анализ 1000 повторений для оценки силы ветвей каждого дерева.

Результаты и обсуждение

Пиросеквенирование, сборка и аннотация

Используя платформу Roche 454 GS-FLX, наш единственный полный цикл двух штаммов тараканов с каждым полуциклом штамма дал в общей сложности 1 365 609 необработанных прочтений со средней длиной 529 п.н.После предварительной обработки исходных данных (включая обрезку адаптера и удаление некачественных прочтений) осталось 1 362 260 прочтений общим объемом 42 110 570 п.н. и средней длиной 520 п.н. Все чистые чтения были собраны в 48 800 контигов и 3 961 синглетонов, образующих в общей сложности 52 761 высококачественный униген со средней длиной 798 п. н. (табл. 1). Из этих unigenes 12 146 (23,0%) имели длину более 1000 п.н., а 5504 (36,7%) имели длину от 500 до 1000 п.н. Распределение длин прочтений и unigenes показано на рисунке 1.

Благодаря последовательному поиску гомологии BLASTx-BLASTn удалось аннотировать почти половину (47,7%) унигенов. Когда все уникальные транскрипты были сопоставлены с базой данных Swiss-Prot с использованием BLASTx, в общей сложности 17 779 (33,7%) уникальных транскриптов дали одно или несколько значимых совпадений. В таблице 2 перечислены характеристики 20 самых распространенных EST (последовательности находятся в файле S1). Помимо некоторых генов домашнего хозяйства с высоким содержанием, некоторые гены, участвующие в репродукции (вителлогенин), защите (трансферрин), энергетическом обмене (ЦОГ1), ферменте детоксикации (CYP4G19) и аллергенных белках, также экспрессировались на высоких уровнях.Количество идентифицированных генов, связанных с некоторыми важными физиологическими функциями немецкого таракана, показано в таблице 3.

Функциональные классификации аннотированных EST

проводили с помощью программ BLAST2GO и WEGO. Из 52 761 unigene 11 383 можно отнести к 48 функциональным группам (рис. 2) в трех категориях. Три категории были дополнительно разделены на более чем 100 подкатегорий (рис. S1). Среди них клетка и клеточная часть в клеточном компоненте, связывание гидролазы и нуклеотида в молекулярной функции, клеточные процессы и метаболические процессы в биологических процессах представляют собой основные подкатегории.Наименьшими группами были металлошапероны в категории молекулярной функции и часть вириона в клеточном компоненте. Некоторые unigenes были отнесены к нескольким категориям терминов GO, в то время как другие не могли быть отнесены к данному термину GO. Термины биологического процесса были связаны преимущественно с клеточными процессами, такими как протеолиз, процессы углеводного обмена и окислительно-восстановительная утилизация. О сходном составе и распределении унигенов, определяемых терминами GO, сообщалось в транскриптомном описании других насекомых [15], [20], [40], [41].

Все уникальные транскрипты также были подвергнуты поиску в базе данных KOG для функционального предсказания и классификации. Поскольку у некоторых из этих унигенов не было подходящей аннотации KOG, было получено 16 612 аннотаций KOG, которые можно было разделить на 25 молекулярных семейств (рис. 3). Среди классификаций KOG кластер общей функции (20,4%) был самым большим, за ним следовали механизмы трансляции и передачи сигнала (10,5%), а также посттрансляционная модификация, обмен белков и шапероны (8.5%). Тремя наименьшими группами были структура ядра (0,57%), защитные механизмы (0,53%) и подвижность клеток (0,33%) соответственно.

Среди всех unigenes 10 402 последовательности с номером классификации ферментов (EC) были картированы в общей сложности в 190 путях KEGG (таблица S2). Среди идентифицированных путей метаболические пути оказались наиболее активными, что аналогично наблюдаемой закономерности у N. lugens [24].

Идентификация локусов простых повторов последовательностей (SSR)

SSR, также известные как микросателлиты, представляют собой тандемно повторяющиеся мотивы из 1–6 оснований и служат наиболее важными молекулярными маркерами в популяционной и природоохранной генетике, молекулярной эпидемиологии и патологии, а также картировании генов. Путем скрининга всех унигенов был идентифицирован 3601 SSR-локус с ди-, три-, тетра- и пентануклеотидными повторами. Среди них наиболее распространены тринуклеотидные повторы (60,7%), за ними следуют динуклеотидные повторы (24,0%), тетрануклеотидные (13,3%) и пентануклеотидные повторы (2,0%). Наиболее частыми мотивами были (AAT)n (6,39%) и (TAT)n (5,69%). Эти SSR могут представлять собой ценный источник биомаркеров B. germanica . Однако все эти предполагаемые маркеры SSR необходимо проверить, чтобы исключить возможные ложные срабатывания и ошибки секвенирования.

Транскрипты, участвующие в пути систематической РНК-интерференции

Процесс РНКи был полностью исследован у D. melanogaster и Caenorhabditis elegans . Предыдущие исследования показали, что систематическая РНКи очень эффективна в изучении функциональных генов тараканов [42]. Сообщалось, что различные белки, такие как SID-1 и рецепторы-мусорщики (SR), участвуют в процессе РНК-интерференции. SID-1 представляет собой белок, который транспортирует дцРНК в клетки, как это наблюдалось в C.элегантный ; однако ортолог SID-1 не был обнаружен в настоящем наборе данных транскриптома или других двукрылых насекомых [43]. Более 90% dsRNA, поглощаемой клетками S2 у Drosophila , инициируется двумя SR, включая SR-CI и рецептор-мусорщик Eater [44]. Ген, ортологичный SR-CI, здесь отсутствовал, а unigene_c62 был идентифицирован как Eater, подобно найденному у плодовой мушки Bactrocera dorsalis [45]. Участвует ли unigene_c62 в поглощении дцРНК в B.germanica еще предстоит исследовать.

В общем, дцРНК или короткая шпилька РНК, встроенная в клетки, процессируется в малую интерферирующую РНК (миРНК) или микроРНК (миРНК) двумя различными комплексами Dicer (Dicer-1 и Dicer-2) соответственно. Dicer-1 является АТФ-независимым и предпочитает процессировать предшественника стержня-петли miRNA, в то время как Dicer-2 отдает предпочтение длинной dsRNA в качестве своего идеального субстрата и требует гидролиза ATP для эффективной продукции siRNA [46]. R2D2 может образовывать комплекс Dicer-2/R2D2 с Dicer-2 и связываться с siRNA для усиления деградации матричной РНК, специфичной для последовательности, опосредованной РНК-инициируемым комплексом молчания (RISC).У Drosophila R2D2 действует как мостик между инициирующей и эффекторной стадиями пути RNAi, облегчая переход siRNA от Dicer к RISC [47]. В настоящем исследовании мы обнаружили четыре unigenes, гомологичных двум генам Dicer немецкого таракана, которые были полностью секвенированы с известной функцией [48], в то время как R2D2 потерян в наборе данных unigene, вероятно, из-за ограничения охвата секвенирования.

Сообщалось, что Argonaute 2 (AGO2) является другим основным компонентом комплекса RISC, участвующим в расщеплении siRNA-направленной мРНК и деградации цепи-пассажира в siRNA-дуплексе [49].Мы обнаружили два гена Argonaute, AGO1 (unigene_c2208) и AGO2 (unigene_c24957), которые демонстрируют высокую гомологию с аналогами T. castaneum (XM_966202) и Acyrthosiphon pisum (XM_001944817). Дальнейшее молекулярное клонирование и функциональный анализ этих генов могут пролить свет на их роль в системном пути РНКи у немецких тараканов.

Транскрипты, кодирующие ферменты детоксикации и мишени для инсектицидов

быстро вырабатывает устойчивость к инсектицидам [50].Известные механизмы, лежащие в основе резистентности к инсектицидам у немецких тараканов, включают снижение проникновения [50], усиление детоксикации [51], нечувствительность к мишеням [52] и отвращение к приманке [53]. Чтобы выявить гены, которые могут развивать устойчивость к инсектицидам, мы изучили текущие транскриптомные данные, чтобы идентифицировать унигены, кодирующие мишени для инсектицидов или ферменты детоксикации. Как показано в таблице 3, был идентифицирован ряд последовательностей, гомологичных ферментам детоксикации, включая карбоксиэстеразу (CarE), глутатион S -трансферазу (GST), цитохром P450 и мишени инсектицида.Средняя длина этих unigenes варьировалась от 387 до 985 п. н., что дает относительно надежную аннотацию.

Всего было идентифицировано и отобрано вручную 163 P450-подобных транскрипта размером более 600 п.н. Это число генов попало в диапазон насекомых, геномы которых были секвенированы [9], охватывая 13 EST P450, ранее депонированных в GenBank. Основываясь на ближайших попаданиях BLAST в базу данных NCBI nr, эти унигены P450 были предварительно отнесены к соответствующим семействам и кладам CYP, содержащим представителей всех 4 основных кланов P450 насекомых (CYP2, CYP3, CYP4 и митохондриальные).CYP3 считается самым большим кланом, состоящим из 45 членов, принадлежащих к семейству CYP6, и 28 генов к CYP9. Члены клана CYP3, по-видимому, обладают общими характеристиками генов реакции на окружающую среду, такими как очень высокое разнообразие и быстрые темпы эволюции [54]. Клан CYP4 включал 39 P450 из семейства CYP4. Остальные принадлежали к клану митохондрий (15 единиц) и CYP2 (22 единицы), которые могли быть вовлечены в путь метаболизма экдистероидов (семейство CYP301) и основные физиологические функции (семейства CYP303–305 и CYP15) соответственно. Наблюдение, что члены семейств CYP4, CYP6 и CYP9 вместе составляют 74,2% от общего числа P450, указывает на то, что немецкий таракан, подобно другим всеядным насекомым, обладает мощной способностью метаболизировать различные ксенобиотики.

Всего в нашей базе данных было идентифицировано 64 последовательности EST, связанных с GST. Однако было обнаружено только 12 контигов, обладающих характерным мотивом CarE, что относительно меньше, чем у других насекомых. Кроме того, в транскриптоме также был идентифицирован ряд контигов, кодирующих белки-мишени инсектицидов, включая ацетилхолинэстеразу (АХЭ) (3 унигена), субъединицы никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР) (2), рецептор гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) (2 гена). ), глутаматный рецептор (12) и натриевый канал (6).

Транскрипты, участвующие во врожденном иммунитете

Насекомые обладают мощным врожденным иммунитетом против многих патогенов [29]. Тараканы сталкиваются с различными видами инфекционных агентов, так как живут в различных антисанитарных и антисанитарных условиях. Логично предположить, что у тараканов выработался эффективный врожденный иммунитет, защищающий себя от патогенных микроорганизмов. Производство разнообразных антимикробных пептидов (AMP) играет решающую роль в иммунитете насекомых [55].AMPs регулируются балансом между двумя сигнальными путями, включающими путь Toll, который активируется в основном грибами и грамположительными бактериями, и путь иммунодефицита (Imd), который активируется в основном грамотрицательными бактериями. Каскады Toll и Imd также контролируют большинство генов, регулируемых микробной инфекцией, в дополнение к генам AMP, и участвуют почти во всех известных врожденных иммунных реакциях [56]. Предыдущие исследования показывают, что лизаты головного мозга, жировые тела или гемолимфа американских тараканов ( Periplaneta americana ) обладают замечательной антимикробной активностью в отношении различных бактерий, включая Staphylococcus aureus , MRSA (грамположительные метициллинрезистентные S.aureus ), S. epidermidis и нейропатогенную Escherichia coli K1 [55].

Десятки генов, идентифицированных в нашем наборе транскриптомных данных, могут способствовать иммунному ответу у B. germanica (таблица 4), включая GNBP, PGRP (белки, распознающие пептидогликаны), SR-b/c, Toll-подобные рецепторы, Imd (иммунный дефицит ген), липополисахарид-связывающий белок (LPS-bp), Iap (ингибитор апоптоза), MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа), профенолоксидаза, лизоцимы, галектин, катепсины, трансферрины, дефенсины, диптерицины и серпины.Большинство из них имеют аналоги у других насекомых, таких как Aedes aegypti [18], Musca domestica [20] и Nilaparvata lugens [24]. Документально подтверждено, что эти гены играют важную роль в качестве факторов иммунного действия против возможных патогенных бактерий [55]–[57].

Транскрипты, участвующие в обонятельном и вкусовом восприятии

Мы идентифицировали семейства генов, которые участвуют в хемосенсорной рецепции (Таблица 3), включая белки, связывающие запах (OBP), хемосенсорные белки (CSP), рецепторы запаха (OR) и вкусовые рецепторы (GR). Подробные последовательности EST представлены в файле S1.

OBP захватывать и транспортировать гидрофобные химические вещества из воздуха в OR в лимфе сенсорных волосков. В этом исследовании было идентифицировано четырнадцать предполагаемых транскриптов OBP. Идентифицированных здесь ОБП значительно меньше, чем у D. melanogaster (51) [58], Bombyx mori (44) [59], Anopheles gambiae (69) [60], Aedes aegypti (111) [60] и Culex quinquefasciatus (109) [60].Мы предполагаем, что есть еще другие неидентифицированные OBP у тараканов, хотя у огненного муравья Solenopsis invicta [61] и платяной воши P. humanus идентифицировано относительно меньше генов, кодирующих OBP (19 и 5 соответственно). 62] геномов. Выравнивание выведенных OBP немецких тараканов (рис. 4A) выявило наиболее яркие шесть консервативных остатков цистеина (первый цистеин C1 отсутствует из-за ограничения длины собранных унигенов), которые присутствуют в характерных положениях во всех известных OBP насекомых.

Рисунок 4. Множественное сопоставление последовательностей выведенных пептидных последовательностей предполагаемых OBP (A) и CSP (B) немецких тараканов с последовательностями других видов насекомых.

Практически полноразмерные аминокислотные последовательности выравниваются с помощью ClustalX в BioEdit. Остатки, заштрихованные синим и желтым цветами, показывают пять и четыре консервативных остатка цистеина в выравнивании OBP и CSP соответственно. Звездочки (*) указывают на идентичные сайты в выравниваниях последовательностей; двоеточия (:) представляют сайты с консервативными заменами, а черные точки (•) обозначают сайты со слабо консервативными сайтами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106932.g004

CSP проявляют экспрессию в антенне, аналогичную OBP, и могут выполнять задачи, варьирующиеся от онтогенеза до регуляции на уровне колонии [63]. CSP характеризуются только 4 консервативными цистеинами, образующими два неблокированных дисульфидных мостика, тогда как 6 консервативных цистеинов спарены в три взаимосвязанных дисульфидных мостика в OBPs [64]. Следовательно, CSP могут представлять собой новый класс растворимых белков-переносчиков, участвующих в хеморецепции насекомых.Семейство генов CSP различается по размерам у членистоногих. Например, клещ Ixodes scapularis имеет 1 ген CSP, D. melanogaster имеет 4, а более крупные известные репертуары обнаружены у T. castaneum (19 генов), B. mori (22 гена) и . S. invicta (21 ген) [65]. О CSP от немецкого таракана ранее не сообщалось. В настоящем исследовании мы идентифицировали в общей сложности 12 фрагментов генов, кодирующих CSP, причем 8 CSP гомологичны CSP7 и CSP18 из T.кастанеум . Четыре CSP с длинной кодирующей областью, идентифицированные в исследовании (рис. 4B), содержали типичную сигнатуру из четырех цистеинов и общий мотив последовательности цистеина C ₁ -X _6-8 -C ₂ -X _{16. -21} -C ₃ -X ₂ -C ₄ CSP насекомых [66].

Чтобы получить представление о взаимосвязях между аннотированными OBP/CSP и их аналогами от других насекомых, мы провели филогенетический анализ с использованием предполагаемых аминокислотных последовательностей. Результирующее дерево, построенное методом объединения соседей, предполагает, что 7 идентифицированных OBP немецких тараканов были сгруппированы в группу, включающую родственные белки двух других видов тараканов ( P. Americana и Rhyparobia Maderae ) и Sitodiplosis mosellana ( мошка цветущей оранжевой пшеницы), в то время как Contig 535 был рассредоточен в нижней части дерева (рис. 5А). В соответствии с их разнообразными функциями OBP имеют высокую расхождение последовательностей (20–30% идентичности аминокислот, см. выравнивание OBP в дополнительной информации) [60], [67].OBP насекомых, вероятно, участвуют в более широких физиологических функциях, не ограничиваясь обонянием [68]. Напротив, CSP различных видов насекомых имеют высокую аминокислотную идентичность (около 50–55%, рис. 5B), что подтверждает точку зрения о высокой консервативности CSP насекомых даже у очень отдаленных видов и подразумевает важную роль, которую они могут играть в физиологии насекомых. [69].

Рисунок 5. Филогения OBP (A) и CSP (B) немецкого таракана и их гомологов.

Консенсусные деревья без корней с 1000 бутстрепными репликами генерируются в MEGA6 [39] с использованием метода объединения соседей.Дерево нарисовано в масштабе с длинами ветвей в тех же единицах, что и эволюционные расстояния, используемые для вывода филогенетического дерева. Все позиции, содержащие пробелы и недостающие данные, удаляются. Номера доступа GenBank и названия видов последовательностей, используемых здесь, показаны в филогенетических деревьях. OBP и CSP немецких тараканов (отмечены •) выделены жирным шрифтом.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106932.g005

ОР играют центральную роль в обнаружении запахов у насекомых.Из-за их высокой вариабельности последовательностей наиболее распространенным методом идентификации генов, кодирующих OR, является анализ баз данных геномных последовательностей [70]. В этом транскриптоме были аннотированы только 2 OR unigenes, что намного меньше, чем у других насекомых.

Сообщалось, что Drosophila содержит семейство из 60 генов вкусовых рецепторов (GR) [71]. Мы идентифицировали 4 транскрипта, кодирующих гомологичный вкусовой рецептор таракана. Два из них (unigene c5971 и unigene rep c30027) размером более 500 п.н. были использованы для анализа их филогении.Как показано на Фигуре 6А, unigene c5971 показал гомологию с несколькими другими GR от разных видов, такими как Gr64f из D. melanogaster . Gr64f и другие семь белков (Gr5a, Gr61a и Gr64a-f) были идентифицированы как сахарные рецепторы (SR) у D. melanogaster [72]. Сахарные рецепторы Drosophila функционируют как мультимеры, и Gr64f широко необходим в качестве корецептора для обнаружения сахаров [73]. Мы предполагаем, что ген c5971, выявленный в этом исследовании, также может быть вовлечен в восприятие сахара немецкими тараканами.Unigene rep c30027 также показал близкое эволюционное расстояние от Gr63a и Gr21a (рис. 6B), которые совместно экспрессируются в CO ₂ -чувствительных нейронах и играют важную роль в поиске пищи у плодовых мушек [74], предполагая участие unigene rep c30027 в поиске еды у таракана. Сохранение этих последовательностей GR между довольно разными видами насекомых, вероятно, отражает неотъемлемую вкусовую чувствительность к определенному химическому веществу или набору химических веществ, свойство, которое позволяет нам предположить их потенциальную функцию.

Blattella germanica демонстрирует большой арсенал генов противомикробных пептидов

Гены, кодирующие белки с доменами AMP в геноме

Для идентификации аннотированных генов с функциями AMP в геноме B. germanica ⁶ использовались две стратегии. Первым был поиск названий продуктов, включая термины защита, дросомицин, тенецин, формицин, аттацин и колеоптерицин. Вторым был поиск аннотированных доменов Pfam, относящихся к антимикробным пептидам.Они включены в три клановых домена базы данных Pfam: Knottin_1 (CL0054, суперсемейство токсиноподобных узлов скорпиона), Defensin (CL0075, суперсемейство токсиноподобных дефенсинов/миотоксинов) и Omega_toxin (CL0083, токсиноподобных омега-подобных). Пять обнаруженных доменов Pfam: PF11581 (Argos), PF03769 (Attacin_C), PF01097 (Defensin_2), PF00304 (гамма-тионин) и PF11415 (Toxin_37). После удаления C0J52_07645 (белок гигантской линзы) и C0J52_08617 (предполагаемый защитный белок 3), поскольку они не кодируют AMP, были сохранены 24 кодирующих гена (дополнительная таблица 1).Первоначально они были разделены на следующие группы: (i) белки Дефенсин_2 (далее Дефенсин) (10 КДС, в том числе две с аннотацией partial = 5′), (ii) Дрозомицин (Гамматиониновый домен) (10 КДС), (iii ) Термицин (домен Toxin_37) (3 CDS) и (iv) CDS C0J52_26498. Последний, аннотированный как гипотетический белок, представлял собой длинный белок (541 аминокислота) с доменом Attacin_C. Однако менее строгий анализ доменов показал потенциальное присутствие двух или трех дополнительных доменов в этом белке, имеющих сходство с Attacin_C и Coleoptericin (PF06286).

Таблица 1 Гены, кодирующие белки с антимикробными пептидными доменами в B. germanica .

Чтобы пересмотреть аннотированные кодирующие AMP гены, несколько экспериментов B. germanica RNA-Seq SRA (PRJNA389591) были проверены на предмет их экспрессии с использованием BLASTN и нескольких AMP CDS в качестве запросов. Среди прогонов SRA с обилием прочтений AMP был выбран прогон RNA-Seq SRR6784710 (все тело, взрослая самка). Прогон SRR6784710 был собран с de novo Trinity ²⁵ , и была создана база данных транскриптов.

Аннотированный геном сравнивали с базой данных транскриптов с целью идентификации полных наборов генов AMP для каждого класса. После тщательной ревизии мы идентифицировали 39 генов АМП (принадлежащих к пяти типам: дефензины, термицины, дросомицины, аттацин-подобные и блаттеллицины), которые будут описаны ниже. Тридцать четыре из них были распределены по десяти геномным каркасам, а пять генов не были размещены (таблица 1; дополнительная таблица 2).

Гены AMP дефензина

Десять аннотированных CDS AMP с доменом дефенсина использовались в качестве запросов к базе данных транскриптов SRR6784710 с BLASTN (значение e = 1. 0E-20). Все они производили хиты хотя бы с одной расшифровкой. Всего было идентифицировано 16 различных транскриптов. Обилие транскриптов варьировалось от значений TPM (транскриптов на миллион транскриптов) от 323,64 до 0,00.

Информация об аннотации генома и собранных транскриптах была сравнена (см. Материалы и методы) с идентификацией 16 генов дефензина (дополнительные таблицы 2 и 3). Они получили названия от defensin_g1 до defensin_g16 , причем defensin_g1 и defensin_g16 включали две альтернативные изоформы, не влияющие на кодирующую область.Изоформы Defensin_g1 i1 и i2 различались по удалению или отсутствию интрона 3′-UTR, тогда как две изоформы defensin_g16 различались по использованию разных сигналов поли(А).

гена дефензина (за исключением defensin_g1 , который не был размещен) были сгруппированы в четыре каркаса. Неразмещенный defensin_g1 был включен, поскольку программа идентифицировала три транскрипта, принадлежащие кластеру TRINITY_DN1123_c0. Один из них (соответствующий defensin_g2 ) мог быть связан с геном C0J52_24001 (кодирующим гипотетический белок), хотя мы восстановили правильную рамку считывания после правильного размещения начала второго экзона.Два других транскрипта показали 100% идентичность, но отличались альтернативным сплайсингом 453-нуклеотидного интрона 3′-UTR. Мы считали их изоформами defensin_g1 , другого гена defensin_g2 , потому что они различались семью нуклеотидами (два в CDS) плюс три инделя разного размера в 3′-UTR. Однако такая последовательность не была обнаружена ни в одной скаффолд-последовательности.

Высокоэкспрессированный транскрипт (TRINITY_DN13842_c0_g1_i1), по-видимому, был получен в результате неправильной сборки с помощью TRINITY ридов четырех разных локусов в геноме с почти идентичными последовательностями (от defensin_g3 до g6 ).Три из них ранее были аннотированы квалификаторами locus_tag C0J52_27569, C0J52_22338 и C0J52_24004. Однако C0J52_27569 (ген = DEFI_4 в каркасе PYGN01003429) представлял собой тандем двух генов ( defensin_g3 и defensin_g4 ). Разрыв сборки, перекрывающийся с defensin_g3 , вероятно, является причиной, объясняющей, почему в геноме была аннотирована единственная мРНК, расширяющая оба гена.

Гены defensin_g7 и defensin_g8 показали идентичные последовательности CDS, но с некоторыми различиями в сегментах UTR последовательностей мРНК.Их помещали в каркасы PYGN01002380 и PYGN01001185 соответственно. Только один из них, defensin_g8 , ранее был аннотирован как ген C0J52_22336.

Defensin_g9 соответствует гену C0J52_24005, кодирующему формицин, белок из 91 аминокислоты. Анализ транскрипта показал, что кодируемый белок короче (71 аминокислота) с последовательностью сигнального пептида из 20 аминокислот на его амино-конце (см. ниже). Defensin_g10 также был Phormicin, расположенным в другом каркасе, но в геноме присутствовал только второй экзон, причем первый экзон, скорее всего, располагался в непрерывном 1-тысячном интервале сборки.

Defensin_g11, g12 и g13 эквивалентны ранее аннотированным генам (дополнительные таблицы 2 и 3). Defensin_g14 присутствует в скаффолде PYGN01001185, но большая часть последовательности второго экзона отсутствует из-за разрыва сборки. Последовательности CDS defensin_g15 и C0J52_20459 были идентичными, но анализ транскриптов defensin_g15 предположил двухэкзонную мРНК вместо трехэкзонной C0J52_20459.

Все дефенсины показали сигнальные пептиды из 18–22 аминокислот на N-конце и домен PF01097 (дефенсин_2) на С-конце (см.1). Длина аминокислотной цепи колебалась от 63 до 81 остатка, в среднем 72 аминокислоты. Хотя некоторые белки Дефензина были идентичными, среднее число попарных различий было высоким (29 аминокислот). Предполагаемая филогения максимального правдоподобия показала их распределение в семи кластерах (рис. 2а). Логотип выравнивания белков белков дефензина показывает гидрофобную N-концевую последовательность, а также домен Дефензина_2 (С-конец) с шестью консервативными остатками цистеина (дополнительный рисунок1).

Организация домена в пяти типах AMP B. germanica . Показан один белок каждого класса. Оранжевые квадраты — это сигнальные пептиды. Красный овал соответствует области, богатой глутамином/глутаминовой кислотой. Зеленые овалы — домены Pfam-A PF03769 (Attacin_C). Синие овалы (сверху вниз) — домены Pfam-A PF01097 (дефенсин_2), PF11415 (токсин_37) и PF00304 (гамма-тионин) соответственно.

B. germanica Филогенез белков дефенсина и дросомицина.( a ) Филогения максимального правдоподобия 18 белков дефенсинов (полученных из транскриптов 16 генов). Модель WAG + I с полным удалением. Длина выравнивания 57 участков. Bootstrap воспроизводит 100. Укоренение в средней точке. ( b ) Филогения белков дросомицина с максимальной вероятностью. Модель Dayhoff + G с полным удалением. Длина выравнивания 66 участков. Bootstrap воспроизводит 100. Укоренение в средней точке. Значения Bootstrap меньше 50 скрыты.

Сравнение уровней транскрипции 16 генов дефенсинов было оценено с использованием стратегии BLASTN, основанной на поиске BLASTN с нуклеотидами 41–190 каждой CDS. Все 150-нуклеотидные последовательности различались, по крайней мере, одним нуклеотидом, за исключением defensin_g3 и g5 , которые были идентичны, и уровень транскрипции не мог быть отнесен к конкретному гену (дополнительная таблица 3). Основываясь на значениях TPM, оцененных TRINITY, и уровнях транскрипции, оцененных с помощью этой стратегии BLAST, мы заметили, что в этом цикле взрослых самок defensin_g15 и g16 (кодирующие дефензин-подобные белки), g9 и g10 ( кодирующие формицин) и g1 , g2 , g3 и g5 (кодирующие белки тенецина-1) являются наиболее высоко экспрессируемыми генами дефензина (дополнительная таблица 3).

С помощью стратегии TBLASTN был проведен поиск транскриптов дефенсинов у 45 видов, охватывающих порядок Blattodea ²⁶ (дополнительная таблица 4). Сорок четыре вида содержат транскрипты дефензина (от 1 до 9).

Гены термицина AMP

Три гена, кодирующие небольшие белки с доменом Pfam PF11415, аннотированы в геноме (дополнительная таблица 1). Поиски BLASTN в базе данных расшифровок SRR6784710 дали совпадения только с двумя очень похожими расшифровками. Первый транскрипт, TRINITY_DN10017_c0_g1_i1, продемонстрировал одно единственное различие либо с C0J52_00758, либо с C0J52_26761 в последовательности CDS, но несколько в оставшейся последовательности мРНК, предполагая наличие двух независимых генов в геноме.Второй транскрипт, TRINITY_DN10017_c0_g2_i1, был на 100% идентичен как CDS, так и мРНК из C0J52_26762, что указывает на третий ген термицина. Три закодированных белка почти идентичны с одной разницей S / A в сайте 13 (дополнительная рис. 1). Сигнальный гидрофобный пептид предсказан между аминокислотами 1 и 19 и доменом Toxin_37 (PF11415) между аминокислотами 30 и 63 (рис. 1). Основываясь на значениях TPM, оцененных TRINITY, и уровнях транскрипции, оцененных BLASTN (сегмент из 150 п.н., охватывающий четыре полиморфных сайта в CDS термицина), мы можем заключить, что termicin_g3 (C0J52_26762) является наиболее высокоэкспрессируемым геном термицина (дополнительный Таблица 5).

мРНК термицина были обнаружены у 29 видов Blattodea, принадлежащих к разным таксономическим семействам (дополнительная таблица 4). Их отсутствие было частым явлением у видов из Corydioidea, что указывает на возможную потерю этого типа гена, хотя нельзя исключать отсутствие экспрессии в этих образцах.

Гены AMP дросомицина

Десять генов, кодирующих белки с доменом гамма-тионина (PF00304), аннотированы в трех каркасах генома B. germanica .Эти противогрибковые белки получили название дросомицинов. Поиски BLASTN аннотированных CDS в базе данных транскриптов SRR6784710 выявили только шесть транскриптов, включая полный CDS, и два незначительных транскрипта, охватывающих только сегмент CDS.

Сравнение аннотированных CDS и полученных из этих транскриптов показало, что только три аннотированных гена (C0J52_03170, C0J52_03171 и C0J52_12810) были эквивалентны трем из этих транскриптов (первый с различиями в 2 нуклеотида).Они были аннотированы как дросомицин_g2 , g3 и g5 (дополнительные таблицы 2 и 6). Один из трех оставшихся транскриптов, соответствующий дросомицину _g 6, может быть помещен в геном с небольшими различиями в нуклеотидах в неаннотированном сегменте. Наконец, последовательности двух других транскриптов не были обнаружены в геноме, хотя их последовательности CDS были очень похожи на C0J52_03170 (с различиями в 6 и 8 нуклеотидов). Эти различия предполагают, что это не аллели, а независимые гены, и мы аннотировали их как дросомицин_g1 и g4 (дополнительные таблицы 2 и 6).

С другой стороны, шесть аннотированных генов с locus_tags, C0J52_12811-13 и C0J52_23105-08, не были обнаружены в транскриптоме взрослых самок, но они, по-видимому, экспрессируются на других стадиях развития. Они были аннотированы как от дросомицин_g7 до g13 .

Филогения 13 белков дросомицина показала, что defensin_g6 был наиболее удаленным геном, в то время как остальные 12 генов образовывали два кластера по шесть генов в каждом. Гены дросомицина _ g1 по g5 , экспрессированные у взрослых самок, плюс неэкспрессированный дросомицин_g9 сформировали одну хорошо поддерживаемую кладу, в то время как другие шесть неэкспрессируемых генов сформировали другую (рис. 2б).

Оценка уровня транскрипции показала, что дросомицин_g5 (C0J52_12810) был геном с наивысшей экспрессией, при этом 86,1% прочтений дросомицина для этого сегмента произошли от него (дополнительная таблица 6).

Двенадцать из 13 закодированных белков имели длину 66 аминокислот. Дрозомицин_g6 имел длину 71 аминокислоту за счет наличия в середине белка дополнительных аминокислот, полученных из двух инделей (сайты 25–26 и 36–38 выравнивания).Среди наблюдаемых остатков наиболее примечательной особенностью кодируемых белков является наличие восьми консервативных цистеинов ²⁷ (дополнительная рис. 1). Все дросомицины имеют сигнальный гидрофобный пептид на N-конце и домен PF00304 (гамма-тионин) на С-конце (рис. 1).

мРНК дросомицина были обнаружены у 24 видов Blattodea, но отсутствовали у видов Isoptera и их близких родственников Cryptocercus wrighti (дополнительная таблица 4).Тот же факт был обнаружен в кладе Corydioidea, что позволяет предположить, что термиты и другие Blattodea могли утратить этот тип гена AMP.

Гены AMP аттацина: аттацин-подобные и блаттеллицины

В области размером 47 т.п.н., охватывающей ген C0J52_26498, помещенный в контиг PYGN01001824, было обнаружено до четырех областей с некоторым сходством с доменом Attacin_C (PF03769). После предварительного анализа собранного транскриптома было идентифицировано более десяти последовательностей мРНК. Они напоминают полные или частичные последовательности мРНК, принадлежащие двум типам генов аттацина.К первому типу относятся гены, кодирующие типичные аттациновые белки (около 120 аминокислот) с сигнальным пептидом на N-конце и доменом Attacin_C на С-конце, которые были названы аттацин-подобными генами. Второй тип сильно отличался, потому что он включал в себя длинный участок остатков глутамина/глутаминовой кислоты. Поскольку они казались очевидной эволюционной инновацией у B. germanica , мы назвали их блаттеллицинами.

В транскриптоме были обнаружены три аттациноподобных транскрипта (дополнительные таблицы 2 и 7). Они содержали кодирующие последовательности из 357–360 нуклеотидов (118–119 кодируемых аминокислот). Они получили имена от attacin-like_g1 до attacin-like_g3 . Извлечение и сборка прочтений этих мРНК подтвердили их существование, но предположили возможность наличия четвертого гена. Attacin-like_g3A и attacin-like_g3B обнаруживают только два отличия: делецию 9-нуклеотидного сегмента в 5’UTR attacin_g3B и синонимическое различие в положении 288 CDS (включение сайтов для два различия в прочтении были очень редкими, учитывая, что длина чтения составляет 301 нуклеотид).Поскольку различий было всего два и они не располагались в геноме, мы посчитали, что это аллели одного и того же гена.

Attacin-like_g1 CDS был относительно похож на attacin-like_g3 CDS с 9–10 различиями. Однако они были достаточно различны, чтобы считаться независимыми локусами. Attacin-like_g2 был наиболее дивергентным геном с 85–88 различиями и дополнительным кодоном по сравнению с другими. Только последовательности attacin-like_g1 и g2 были расположены в геноме (дополнительные таблицы 2 и 7).

Расшифровка блаттеллицинов была намного сложнее. После предварительного анализа была обнаружена длинная CDS (> 250 кодонов) с любопытной структурой. Он начинается с гидрофобного сигнального пептида на N-конце, за которым следует длинный сегмент, богатый Glx, в середине (> 70 остатков, в основном глутамины и глутаминовые кислоты) и С-концевой домен аттацина (рис. 1).

Было обнаружено до 13 транскриптов мРНК (все они содержат неполные сегменты CDS), включающих этот тип последовательностей.Основные причины заключались в том, что присутствие нескольких генов блаттелицина и длинных областей, богатых Glx, резко влияло на сборку транскриптома. Вероятно, этот факт имел место при сборке и аннотации генома B. germanica ^5,6 .

5′-последовательность CDS блаттеллицина использовали в качестве запроса для идентификации с помощью BLASTN тех прочтений, которые произошли от экспрессии генов блаттеллицина в цикле SRR6784710. После экстракции и сборки было выявлено четыре разных начала генов блаттелицина с различиями в диапазоне от 7 до 18 попарных нуклеотидов в 5′-конце мРНК.Эти четыре старта мРНК использовали для рекрутирования оставшихся последовательностей генов до завершения CDS.

Большая часть последовательности CDS для blattellicin_g1 может быть идентифицирована в геноме, хотя около 200 п.н. отсутствовали из-за двух пробелов в сборке (дополнительные таблицы 2 и 7). Для остальных только первый кодирующий экзон blattellicin_g2 и g4 может быть однозначно отнесен к определенному сегменту контига, хотя совпадения для других сегментов CDS также были обнаружены, но без 100% идентичности.В геноме не удалось идентифицировать последовательность, идентичную первому экзону blattellicin_g3 . Наиболее правдоподобное объяснение состоит в том, что четыре гена блаттеллицина присутствуют в тандемных копиях в геноме, но их особая структура центрального повтора препятствует правильной сборке либо в геноме, либо в транскриптомах, за исключением случаев, когда выполняется ручная проверка выравниваний. Кроме того, нельзя исключать вариации числа копий кодона Glx в популяции.

Мы обнаружили, что блаттеллицины экспрессировались на более высоком уровне, чем аттацин-подобные гены, при этом blattellicin_g4 был наиболее высоко экспрессирован в этом транскриптоме (дополнительная таблица 7).

Логос выравнивания белков для трех аттацин-подобных и четырех блаттеллициновых белков B. germanica выявил небольшой сегмент отрицательно заряженных аминокислот в аттацин-подобных белках и длинный сегмент в блаттеллицинах (рис. 3).

Логотипы выравниваний и аминокислотный состав B. germanica Аттацин-подобных и блаттеллициновых белков. ( a ) Логотип выравнивания трех аттацин-подобных белков. ( b ) Логотип расстановки четырех блаттеллицинов.( c ) Средний аминокислотный состав (%) аттацин-подобных и блаттеллициновых белков.

мРНК аттацина были обнаружены у большинства видов Blattodea (дополнительная таблица 4). Находки для блаттеллицинов не охватывают область Glx, а только домен attacin_C. Чтобы понять эволюционную историю аттацин-подобных и блаттеллициновых генов у B. germanica , мы извлекли транскрипты аттацина из семи проектов Blattellinae TSA ²⁶ ( Symploce sp .AD-2014, Loboptera decipiens, Episymploce sundaica , Ischnoptera deropeltiformis, Paratemnopteryx couloniana, Lobopterella dimidiatipes, Asiablatta kyotensis ). Эти транскриптомы происходят от целых тел взрослых, за исключением I. deropeltiformis (без информации о стадии развития). Потенциально они могут охватывать все гены аттацинов для каждого генома, хотя нельзя исключать возможность существования генов без экспрессии. Наибольшее количество генов аттацина было три у E.сундайка . Два гена наблюдались у L. decipiens , Symploce sp. AD-2014 и A. kyotensis , хотя у первого одна из копий была неполной и очень дивергентной, вероятно, псевдогеном, а у второго две копии были неполными на несколько кодонов на 5′-конце CDS. . Проект SRA был проверен на наличие прочтений, охватывающих начало CDS, и, основываясь на восстановленных, один был завершен, а в другом были пропущены только четыре кодона. Остатки видов содержали одну копию гена.Кроме того, для использования в качестве внешней группы был извлечен единственный обнаруженный в P. americana .

Филогению проводили с усеченным выравниванием (103 сайта) (рис. 4). Короткая длина выравнивания последовательности предотвратила высокие значения начальной загрузки в большинстве узлов и затруднила определение с полной уверенностью эволюционной истории этого семейства генов. Тем не менее, несколько фактов наблюдаются из филогении. Во-первых, аттацин-подобные гены относятся к типу предковых генов. Некоторые виды Blattellinae содержат только один или два гена.В случае клады B. germanica , E. sundaica , L. decipiens и Symploce sp . AD-2014, перед их дивергенцией произошла дупликация предкового аттацин-подобного гена, что привело к появлению типов attacin-like_g1 и g2 . Хотя L. decipiens attacin-like_g1 не был включен в филогению, неполная и дивергентная копия транскрипта этого типа (GDYK01026461.1), вероятно, происходит от псевдогенизированной копии.

Филогенез белков аттацина и блаттеллицина у Blattellinae. ( a ) Филогения максимального правдоподобия белков, содержащих домен Attacin_C в подсемействе Blattellinae. Модель LG + G с полным удалением. Выравнивание обрезали, чтобы соединить N-концевой сигнальный пептид плюс С-концевой домен attacin_C (длина 103 сайта). P. americana использовали в качестве внешней группы. Bootstrap копирует 100.Значения Bootstrap меньше 50 скрыты. Все названия видов сокращены (см. коды в правой топологии), кроме Symploce sp. Белки без сокращений представляют собой белки из B. germanica . ( b ) Таксономические отношения согласно ²⁶ .

Блаттеллицины появились совсем недавно. Хотя это и не подтверждается значительным значением начальной загрузки, потенциально предковый ген типа attacin-like_g2 был продублирован, и одна из копий после быстрой эволюции продуцировала блаттеллицины. Дублирование произошло до расхождения E. sundaica и B. germanica . Белок в первом, по-видимому, является пре-блаттеллицином, включая некоторые новые характеристики блаттеллицинов, такие как большой размер (182 остатка) и несколько дополнительных аминокислот на С-конце (RK в B. germanica и GKGK). в E. sundaica ). Однако основная характеристика блаттеллицинов, длинная поли-Glx область, отсутствует, хотя пре-блаттеллицин E. sundaica включает дорожку из семи глутаминовых кислот (с буквой А в середине), близкую к началу аттацина. домен.

Экспрессия AMP в

Для определения экспрессии генов AMP в тканях B. germanica , стадиях развития или полах мы выбрали CDS 17 типов генов AMP (defensin_g2 , g3 , g7 , g9 5 g9 9 9 9 , G13 и G15 9052 и G15 ; TERMICIN_G1 ; DROSOMECIN_G1 , G5 , G6, G11 и G12 ; G12 _ G1 и G2 ; Blattellicin_G1 и г4 ). Они достаточно различны, чтобы избежать важных перекрестных результатов среди выбранных из одной и той же группы. Однако из-за высокого сходства CDS некоторых генов из одного семейства полученные значения свидетельствовали об экспрессии наборов генов с практически идентичными последовательностями (например, трех генов термицина или аттацин-подобных_g1 и g3). ).

Уровни экспрессии были оценены с помощью стратегии BLASTN как количество совпадений/Гб эксперимента SR (дополнительная таблица 8).Анализ тепловых карт 28 экспериментов SR всего тела, соответствующих образцам с разных стадий развития (рис. 5), позволил сделать несколько выводов. Во-первых, взрослые самки демонстрировали высокую экспрессию большинства генов AMP, хотя наиболее значимой была самая высокая экспрессия blattellicin_g1 и g4 . Некоторые дросомицины также были высоко экспрессированы, особенно drosomycin_g5 . Экспрессия некоторых генов была связана с развитием (см., например, отсутствие экспрессии дросомицина g11 и g12 у взрослых самок, но высокая экспрессия у нимф). Среди дефенсинов наиболее высоко экспрессировались на большинстве стадий развития defensin_g9 и g15 . Экспрессия дефензина g2 и g3 была выше у взрослых самок, чем у нимф. Termicin_g1 проявлял низкую экспрессию у нимф и взрослых особей. Аттацин-подобные гены также были экспрессированы у взрослых самок, при этом значения attacin-like_g1 были выше, чем у attacin-like_g2 , что согласуется с ранее описанными результатами (дополнительная таблица 7), также учитывая, что обнаруженные совпадения для attacin-like_g1 , вероятно, происходит от генов g1 и g3 .

Рисунок 5

Экспрессия 17 генов AMP в целых телах B. germanica . Анализ тепловой карты, иллюстрирующий обилие транскриптов для 17 выбранных генов AMP в 28 экспериментах по считыванию последовательностей, соответствующих целым телам на разных стадиях развития B. germanica , с указанием, в некоторых случаях, пола образца. Значения оценивались как частное между количеством чтений, дающих попадание с e-значением меньше 1,0E-40 (с использованием полных последовательностей CDS в качестве запросов в поиске BLASTN), и размером эксперимента SR в гигабайтах.

Как правило, экспрессия генов AMP увеличивается по мере развития взрослых форм. К сожалению, в базе данных SRA не было размещено ни одного эксперимента SR исключительно для взрослых самцов, хотя сообщается о некоторых смешанных образцах самцов и самок (дополнительная таблица 8).

Мы также проанализировали экспрессию этих 17 генов AMP в некоторых экспериментах по транскриптомной SR, в которых образцы были получены из одной ткани, части тела или смеси нескольких тканей (дополнительная таблица 8).В целом, дросомицин_g5 и дефензин_g9 , по-видимому, экспрессируются в большинстве этих образцов. В двух экспериментах на головах взрослых самцов несколько генов AMP экспрессировались до соответствующего уровня, включая дефенсин_g7 и g9 , дросомицин_g5 и аттацин-подобный_g2 . В целом уровень экспрессии в этих образцах намного меньше, чем у целых тел. Это заставляет нас предположить, что другие части тела, отличные от жирового тела, яичников или эпидермиса, ответственны за высокие уровни экспрессии, наблюдаемые у взрослых самок в целом (рис.5).

Никакой экспрессии blattellicin_g1 и blattellicin_g4 не наблюдалось ни в одной ткани или части тела, за исключением почти неопределяемой экспрессии в одном образце неоплодотворенных яиц, вероятно, из-за контаминации тканями самки.

Цветение один или несколько раз: механизмы повторного цветения Iris germanica, выявленные с помощью профилирования транскриптома | BMC Genomics

Построение секвенированной гибридной популяции и анализ фенотипических признаков гибридов

После искусственного кастрации и опыления I.germanica ‘D’ и ‘H’, всего было получено 366 проростков F ₁ .

В популяции F ₁ частота цветения весной составляла 65,23%, а частота повторного цветения осенью — 27,94%, что позволяет предположить, что в одной и той же гибридной популяции существовали однократно цветущие и повторно цветущие растения (дополнительный файл 1: таблица S1). ). Идентичное происхождение и разные признаки цветения сделали их идеальным растительным материалом для изучения наследственной модели повторного цветения. Кроме того, скорость завязывания семян осенью (37.50%) было больше, чем у весны (30,00%), что указывает на возможный подход к получению большего количества гибридов осенью.

Фенотипические характеристики поколения F ₁ отличались от таковых у их родителей. Весной фенотипические значения LL (длина листа) и HF (высота отдельного цветка) у F ₁ были выше, чем у их родителей, что указывает на то, что F ₁ имел более длинные листья и более высокие отдельные цветки (таблица 1). . Однако фенотипическое значение NFS (количество цветков на черешке) весной было меньше, чем у их родителей, что предполагает меньшее количество цветков на стебле F ₁ .В период повторного цветения (осень) фенотипические значения PH (высота растения) и DF (диаметр цветка) были меньше, чем у родителей, снижение которых может быть связано со сравнительно холодным климатом осенью. Однако NLBS (количество листьев на цветущий стебель) F ₁ осенью было больше, чем у родителей, что указывает на то, что F ₁ нуждается в большем накоплении питательных веществ для повторного цветения, чем их родители. Отрицательные значения PV _s-a (разница между фенотипическими значениями весной и осенью) в NLBS и NFS показали, что F ₁ нуждается в большем накоплении питательных веществ для повторного цветения осенью, чем для цветения весной.В результате F ₁ может дать больше цветков на стебле осенью, чем весной.

Таблица 1 Фенотипические значения десяти фенотипических признаков Iris germanica весной и осенью ‘D’ ×  I. germanica ‘H’

Экстракция РНК, секвенирование РНК и сборка

Десять библиотек тотальной РНК использовались для высокопроизводительного секвенирования (таблица 2, дополнительный файл 2: рис. S1). После обрезки необработанных данных было получено в общей сложности 428 442 355 чистых прочтений из транскриптома RB (rebloomers) и 307 674 756 чистых прочтений из транскриптома OB (once-bloomers) (таблица 3). Проценты Q30 для транскриптома RB и OB составили 89,00 и 90,36% соответственно. Кроме того, содержание GC составило 50,49 и 50,47% для транскриптома RB и OB соответственно, что свидетельствует о высоком качестве данных секвенирования.

Таблица 2. Выбранные стадии и выбранные типы цветения при секвенировании транскриптома Таблица 3. Резюме секвенирования транскриптома Illumina

файл 1: Таблица S2).N50 собранных унигенов составлял 1368 п.н. Всего для транскриптов было получено 203 398 транскриптов со средней длиной 985 пн, N50 из которых составил 1533 пн. Процент unigenes с размером последовательности между 200 bp и 300 bp был самым большим, за ним с небольшим отрывом следовали гены размером от 300 bp до 400 bp (дополнительный файл 2: рис. S2). Приведенные выше данные показали высокое качество собранных унигенов.

Функциональная аннотация уникальных генов

В общей сложности 49 824 уникальных гена были аннотированы в пяти общедоступных базах данных, включая NCBI Неизбыточные белковые последовательности (Nr), Генную онтологию (GO), Кластеры ортологичных групп (COG), Киотскую энциклопедию генов и Genomes (KEGG) и Swiss-Prot. Количество аннотированных унигенов в Nr, GO, COG, KEGG и Swiss-prot составило 46 783, 29 310, 14 063, 19 071 и 30 697 соответственно (дополнительный файл 1: таблица S3).

В соответствии с распределением E-значения BLAST по базе данных Nr, 49,68% совпадающих последовательностей показали высокую гомологию с E-значением < 1,0E-50, в то время как 50,32% из них имели E-значение > 1,0E- 50 (рис. 1А). Распределение сходства лучших совпадений BLAST показало, что 46,19% совпадающих последовательностей имели сходство выше 80% (рис.1Б). В тройку лучших видов, имеющих гомологию с I. germanica , вошли Zea mays (24,80%), Asperagus officinalis (20,45%) и Elaeis guineensis (9,47%) (рис. 1C). Все эти три вида являются однодольными, как и I. germanica , что позволяет предположить, что сборка и аннотации транскриптома RB и OB ириса являются правильными и надежными.

Рис. 1

Характеристики радужной оболочки unigenes по сравнению с базой данных неизбыточных белковых последовательностей (Nr) NCBI. (A) Распределение E-значения попаданий BLAST для каждого унигена с отсечкой E-значения 1,0E-11. (B) Распределение подобия лучших попаданий BLAST для каждого унигена. (C) Распределение видов лучших результатов BLAST

В анализе GO 29 310 unigenes были отнесены к 42 терминам GO по трем категориям (рис. 2A, дополнительный файл 1: таблица S3). Высокий процент унигенов был отнесен к «клетке», «части клетки», «органелле» и «мембране» в категории «клеточный компонент». Пропорции «каталитической активности» и «связывания» были самыми большими в категории «молекулярная функция».«Метаболический процесс» и «клеточный процесс» больше всего занимали категории «биологический процесс» (рис. 2А, дополнительный файл 1: таблица S4).

Рис. 2

Функциональный анализ всех генов GO и KEGG. (A) GO функциональная классификация всех unigenes. Левая ось Y указывает процент аннотированных unigenes. Правая ось Y указывает количество аннотированных unigenes. (B) Отнесение 90 551 unigenes I. germanica 90 552 к 20 основным биологическим путям KEGG

В общей сложности 19 071 unigenes были аннотированы в базе данных KEGG и были назначены 129 путям KEGG (Дополнительный файл 1: Таблица S3 и Таблица S5) .Стоит отметить, что «передача сигнала растительного гормона» была среди 20 основных путей KEGG, которые были тесно связаны с цветением (рис. 2Б). Эти 20 основных путей являются ценным ориентиром для изучения конкретных процессов, функций и путей во время развития цветка I. germanica .

Функциональная аннотация дифференциально экспрессируемых генов (DEG)

DEG были отфильтрованы из сравнения трех стадий, включая стадию цветочной инициации весеннего цветения у однократно цветущих растений (OB-T1), фазу цветочной инициации весеннего цветения (RB -T1) и осеннее цветение (RB-T5) в повторных цветках.В общей сложности 690, 3515 и 2941 DEG были аннотированы по пяти общедоступным базам данных (Nr, GO, COG, KEGG и Swiss-prot) из сравнения OB-T1 с RB-T1, RB-T1 с RB-T5 и OB-T1 против RB-T5 соответственно (таблица 4). При сравнении OB-T1 и RB-T1 в общей сложности 1363 гена были дифференциально экспрессированы (786 с повышенной экспрессией и 577 с пониженной регуляцией). Количество DEG в RB-T1 по сравнению с RB-T5 и OB-T1 по сравнению с RB-T5 составляло 4742 (2511 с повышающей регуляцией и 2231 с пониженной регуляцией) и 4017 (2293 с повышающей регуляцией и 1724 с пониженной регуляцией) соответственно (рис. .3а, Дополнительный файл 1: Таблица S6, Дополнительный файл 2: Рис. S3). Среди этих DEG некоторые гены могут регулировать весеннее цветение и осеннее повторное цветение. Кроме того, на диаграмме Венна во всех трех сравнениях существовало всего 27 DEG (рис. 3b).

Таблица 4 Статистический анализ аннотации ДЭГ в различных сравнениях Рис. 3

ДЭГ на разных этапах разработки. (A) Количество DEG в различных сравнениях, включая OB-T1 против RB-T1, RB-T1 против RB-T5 и OB-T1 против RB-T5.(B) Диаграмма Венна количества уникальных и общих DEG среди сравнений между OB-T1 против RB-T1, RB-T1 против RB-T5 и OB-T1 против RB-T5

Путь KEGG и анализ обогащения GO DEG

ДЭГ были аннотированы в базах данных KEGG и GO для дальнейшего определения их биологических функций. Приписанные функции DEG охватывают широкий спектр терминов KEGG и GO, что указывает на то, что данные транскриптома представляют широкий спектр транскриптов в I. germanica .

В анализе пути KEGG мы в основном сосредоточились на «передаче сигналов гормонов растений» в категории «обработка информации об окружающей среде» и «циркадный ритм растений» в категории «системы организма», которые были тесно связаны с цветением. растений. При сравнении OB-T1 и RB-T1 два DEG были аннотированы в путь «трансдукции сигнала растительного гормона», а пять DEG были аннотированы в путь «циркадный ритм-растение» (дополнительный файл 1: таблица S7, дополнительный файл). 2: Рис.С4). При сравнении RB-T1 и RB-T5 количество DEG, аннотированных в пути «передачи сигнала растительного гормона» и пути «циркадный ритм-растение», составляло 43 и 25 соответственно (дополнительный файл 1: таблица S8, дополнительный файл 2). : рис. S4). Точно так же при сравнении OB-T1 и RB-T5 количество DEG, аннотированных в пути «передачи сигнала растительного гормона» и пути «циркадный ритм-растение», составляло 38 и 20 соответственно (дополнительный файл 1: таблица S9, дополнительный файл 2: рис. S4). Кроме того, эти два пути были перечислены в топ-20 наиболее обогащенных путей KEGG (рис.4), которые подтверждают, что DEG в этих двух путях, вероятно, играют существенную роль в повторном цветении. Рисунок 4 DEG из трех сравнений (OB-T1 против RB-T1, RB-T1 против RB-T5, OB-T1 против RB-T5), «метаболический процесс» был наиболее обогащен терминами GO в категории «биологический процесс»; «клетка» была наиболее аннотирована в категории «клеточный компонент»; «каталитическая активность» была наиболее распространена в категории «молекулярная функция» (дополнительный файл 1: таблица S10, дополнительный файл 2: рис.С5). Излишние термины GO были удалены, а различия GO между тремя сравнениями были визуализированы в анализе Reduce and Visualize GO (REVIGO). Термины GO в части «биологический процесс», такие как фотосинтез, сбор света в фотосистеме I (GO:0009768), биосинтез ауксина (GO:0009851) и инициация меристемы (GO:0010014), были сильно обогащены во всех трех случаях. сравнения (рис. 5A-C). Акклиматизация к холоду (GO:0009631) и детектирование видимого света (GO:0009584) были сильно обогащены в двух сравнениях.Аналогично, антенный комплекс фотосистемы I (GO:0009782), фотосистема I (GO:0009522) и светособирающий комплекс (GO:0030076) в части «клеточного компонента» (рис. 5D-F) и активность фоторецепторов синего света ( GO:0009882) и активность фоторецепторов (GO:0009881) в части «молекулярной функции» (рис. 5G-I) были выше во всех трех сравнениях. Разумно заключить, что формирование повторного цветения может быть связано со светочувствительностью, холодовой акклиматизацией и скоростью роста.

Рис. 5

Анализ путей GO для DEG в трех сравнениях (OB-T1 против RB-T1, RB-T1 против RB-T5, OB-T1 против RB-T5) с использованием REVIGO.(A, B и C) представляют биологический процесс (BP) в OB-T1 по сравнению с RB-T1, RB-T1 по сравнению с RB-T5 и OB-T1 по сравнению с RB-T5 соответственно; (D, E и F) представляют собой клеточные компоненты (CC) в OB-T1 по сравнению с RB-T1, RB-T1 по сравнению с RB-T5 и OB-T1 по сравнению с RB-T5 соответственно; (G, H и I) представляют молекулярную функцию (MF) в OB-T1 по сравнению с RB-T1, RB-T1 по сравнению с RB-T5 и OB-T1 по сравнению с RB-T5 соответственно. Цвет пузырька представляет log10 (значение P ) частоты ложных обнаружений, как показано на шкале справа. Большой размер пузырьков указывает на обогащение терминов GO

Гены, связанные с циркадным ритмом, и гены пути фотопериода могут регулировать повторное цветение

Циркадные часы являются вдохновителем жизни растений, поскольку было доказано, что они участвуют в росте, развитии и физиология.Циркадные часы обеспечивают не только функции прогнозирования времени, но и адаптируемость к изменяющимся условиям окружающей среды [16,17,18,19]. Повторное цветение, как важное событие развития, может зависеть от профиля экспрессии генов, связанных с циркадным ритмом. Следовательно, гены, связанные с фотопериодом, как один из выходных путей циркадианных часов, могут участвовать в формировании повторного цветения.

При сравнении двух стадий инициации цветения у повторных цветков (RB-T1 и RB-T5), ПОДАВИТЕЛЬ ФИТОХРОМА A1 ( SPA1 ) , ФИТОХРОМ A ( PHYA 5PHYA 905CHROM ), CRY ) и GIGANTEA ( GI ) были значительно активизированы в RB-T5 по сравнению с RB-T1 (рис. 6). Напротив, PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 9 ( PRR9 ) и CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 ( CCA1 ) были значительно подавлены в RB-T5 по сравнению с RB-T1. Более того, при сравнении двух стадий инициации цветения у однократно цветущих растений и повторно цветущих растений (OB-T1 против RB-T5) CCA1 , GI , SPA1 , PHYA и CRY были значительно выше. регулируется. Однако ни один ген не был значительно подавлен в OB-T1 по сравнению с RB-T5.

Рис. 6

Тепловая карта ДЭГ в пути фотопериода. Темно-синий цвет указывает на относительное увеличение экспрессии, а светло-синий — на относительное снижение экспрессии. SPA1 : ПОДАВИТЕЛЬ ФИТОХРОМА A1 ; CCA1 : СУТОЧНЫЕ ЧАСЫ 1 ; PHYA : ФИТОХРОМ А ; CRY : КРИПТОХРОМ ; PRR9 : ПСЕВДООТВЕТ РЕГУЛЯТОРА 9 ; GI : GIGANTEA ; ОБ: однократно цветущие; РБ: реблумеры. T1-T6 представляет шесть стадий развития в Таблице 2

Нечувствительность к температуре приводит к более чем одной инициации цветения

Как однократно цветущие, так и повторно цветущие растения могут инициировать первый цветочный переход в конце октября каждого года. У однократно цветущих только после яровизации зимой цветочные почки могли закончить дальнейшее развитие и распуститься в мае. Однако повторно цветущие растения могут инициировать второй цветочный переход в начале июня и зацвести в октябре без яровизации.Следовательно, температурная чувствительность может быть разной у повторноцветущих и однократно цветущих растений, а гены, связанные с яровизацией, могут оказывать некоторое влияние на формирование повторного цветения.

Гены навязки навязки, Фотопериод-независимое раннее цветение 1 ( Pie1 ), FRIGIDA ( FRI ) и нечувствительности навязки 3 ( VIN3 ) были рассмотрены как DEG (дополнительный файл 2: Рис. С6). Экспрессия цветочного репрессора FLOWERING LOCUS C ( FLC ) регулировалась с помощью FRI , VIN3 и PIE1 .Однако отсутствие FLC в DEG указывает на то, что его экспрессия была относительно стабильной во время развития цветка, вероятно, из-за взаимодействий его вышестоящих генов, компенсирующих друг друга. В результате температурные колебания мало влияли на закладку и развитие цветков, что способствовало повторной закладке цветков и развитию цветочных почек летом.

Быстрая скорость роста способствует двойному цветению в год.

В отличие от однократно цветущих, повторно цветущие растения могут проходить циклы от вегетативного до репродуктивного роста два раза в год.Повторно цветущие растения начали свой второй цветочный переход в начале июня и могли зацвести в октябре. Укороченный вегетационный период свидетельствует о более высокой скорости роста. Следовательно, некоторые ДЭГ, относящиеся к скорости вегетативного роста, могут регулировать формирование повторного цветения.

Среди всех 70 предполагаемых ДЭГ из сравнения двух соседних периодов выборки (рис. 7a-b) три ДЭГ были отнесены к пути «метаболизма крахмала и сахарозы» в базе данных KEGG (рис. 7c). Гены этого пути регулируют метаболизм крахмала и сахарозы, которые являются основными материалами для вегетативного роста.Кроме того, было обнаружено, что один AUXIN RESPONSE FACTOR ( ARF ) дифференциально экспрессируется во всех сравнениях двух соседних периодов у повторноцветущих растений, но отсутствовал у аналогов однократно цветущих растений (рис. 7г). Вегетативный рост между стадией бутонизации весеннего цветения (T4) и стадией начала цветения осеннего цветения (T5) был важен для повторного цветения. У повторноцветущих растений уровень экспрессии ARF в T5 был намного выше, чем в T4, что делает его ключевым геном-кандидатом для ускорения вегетативного роста.Кроме того, были отфильтрованы три DEG, связанные с функцией клеточной стенки (рис. 7e), в том числе TRICHOME BRIRFRINGENCE-LIKE (TBL), WAT1-RELATED и EXPANSIN-A16-LIKE (EXPA16) . Уровень экспрессии этих трех генов у RB-T2 (стадия после входа в состояние покоя повторно цветущих растений) был выше, чем у RB-T1, тогда как OB-T2 (стадия перехода в состояние покоя у однократно цветущих растений) был ниже, чем у OB-T1. Это указывало на то, что функция клеточной стенки была все еще активна у повторно цветущих до перехода в состояние покоя, но слаба у однократно цветущих.Активная функция клеточных стенок гарантировала быстрый рост повторно цветущих растений, позволяя завершить два цикла цветения за один год.

Рис. 7

Анализ генов, связанных с ростом. (A) Диаграмма Венна двух соседних стадий повторного цветения. «1» представляет DEG в RB-T4 по сравнению с RB-T5; «2» представляет DEG в RB-T3 по сравнению с RB-T4; «3» представляет DEG в RB-T1 по сравнению с RB-T2; «4» представляет DEG в RB-T6 по сравнению с RB-T1; «5» представляет DEG в RB-T5 по сравнению с RB-T6. (B) Диаграмма Венна двух соседних стадий повторного цветения и однократного цветения. «6» представляет DEG в OB-T1 по сравнению с OB-T2; «7» представляет DEG в OB-T3 по сравнению с OB-T4; «8» представляет 119 DEG в «1»-«5» на фиг. 7A. (C) Тепловая карта DEG, аннотированная в путь «метаболизма крахмала и сахарозы» в базе данных KEGG. (D) Тепловая карта AUXIN RESPONSE FACTOR ( ARF ). (E) Тепловая карта DEG, связанных с функцией клеточной стенки. Темно-синий цвет указывает на относительное увеличение экспрессии, а светло-синий — на относительное снижение экспрессии. T1-T6 представляет шесть стадий развития в таблице 2.OB и RB представляют однократно цветущие и повторно цветущие растения, соответственно

Предполагаемая регуляторная сеть повторного цветения

Получая сигналы от восходящих генов сети регуляции циркадных ритмов, пути фотопериода, пути яровизации и пути, связанного с ростом, регуляторы цветения будут интегрировать эти сигналы и оказывать некоторое влияние на цветение. КОРОТКИЙ ВЕГЕТАТИВНЫЙ ПЕРИОД ( SVP ), важный подавитель цветения, был идентифицирован как DEG при сравнении RB-T1 и RB-T5 (рис. 8). У повторно цветущих растений уровень экспрессии SVP во второй период инициации цветения (RB-T5) был намного ниже, чем в первом периоде (RB-T1), таким образом захватывая вторую инициацию цветения. Однако другой репрессор цветения TFL1 , контролирующий ремонтантное цветение у розы и земляники [11, 12, 24], показал более высокий уровень экспрессии во второй период инициации цветения, причина которого требует дальнейшего изучения. Несмотря на это, экспрессия двух промоторов цветения APETALA 1 ( AP1 ) и FLOWERING LOCUS T ( FT ) в RB-T5 была усилена по сравнению с T1, что явилось прямой причиной повторного цветения.

Рис. 8

Предполагаемая сеть регуляторов развития цветков повторно цветущего бородатого ириса. Эта регуляторная сеть была модифицирована и интегрирована на основе результатов секвенирования транскриптома генов, связанных с циркадным ритмом, генов пути цветения (включая пути яровизации и фотопериода) и генов пути, связанного с ростом. Темно-синий цвет указывает на относительное увеличение экспрессии, а светло-синий — на относительное снижение экспрессии. T1-T6 представляет шесть стадий развития в таблице 2.OB и RB представляют собой однократно цветущие и повторно цветущие растения, соответственно

Белково-белковые взаимодействия между предполагаемыми регуляторными генами на рис. 8 были проанализированы в базе данных STRING (дополнительный файл 2: рис. S7A). При анализе узловых генов с помощью Cytoscape GI был идентифицирован как узловой ген, взаимодействующий со всеми 10 основными узлами взаимодействия (дополнительный файл 2: рис. S7B). Кроме того, PHYA и FT вошли в топ-10 узлов взаимодействия. Таким образом, GI , PHYA и FT могут быть ключевыми регуляторами развития цветков и играть существенную роль в формировании повторно цветущих растений.

Проверка результатов секвенирования РНК с помощью qRT-PCR

Чтобы проверить надежность данных секвенирования транскриптома, мы случайным образом выбрали десять DEG, связанных с цветением, и провели qRT-PCR, используя те же образцы, что и при секвенировании транскриптома. Ген радужной оболочки ACTIN использовали в качестве эндогенного эталонного гена. Результаты показали, что уровни экспрессии выбранных генов в основном соответствовали результатам секвенирования РНК (рис. 9), что подтвердило достоверность данных транскриптома, собранных de novo, и последующего анализа.

Рис. 9

Профили экспрессии десяти DEG. Узоры экспрессии Zeitlupe ( ZTL : C199419.Graph_c0), Pseudo-ответный регулятор 9 ( PRR9 : C179389.Graph_c0), Catein Kinase 2α ( CK2α : C184758.Graph_c0), ПОДАВИТЕЛЬ ФИТОХРОМА A1 ( SPA1 : c187691.graph_c0), CONSTANS ( CO : c195512.graph_c0), ФИТОХРОМ A ( PHYTOCHROME 2 c3.graph_c0Graph_c1), Cryptochrome ( Cry : C162440.Graph_c0), FRIGIDA ( FRI : C187374.Graph_C2), APETALA 1 ( AP1 : C169299.Graph_C0) и Супрессор из сверхэкспрессии конденсов 1 ( SOC1 : c161397. graph_c0) определяли с помощью qRT-PCR (относительная экспрессия по сравнению со стадией T1) и анализа РНК-seq (значения FPKM). Столбики погрешностей представляют собой стандартное отклонение средних значений. T1-T6 представляет шесть стадий развития в таблице 2.OB и RB представляют однократно цветущие и повторно цветущие растения, соответственно

Экспериментальный дизайн. Антибиотик канамицин был применен к…

Контекст 1

… и разнообразию кишечного микробиома B. germanica. Мы провели метагеномное секвенирование дробовиком у 15 взрослых самок на 0, 10 и 30 день первого поколения (G1) и у 60 особей второго поколения (G2), включая 24 нимфы (на 22 и 34 дни) и 36 взрослых самок. (в дни 0, 10 и 30) (рис.1). В среднем было получено 782 400 прочтений на образец, и 83% прочтений прошли фильтрацию качества и очистки (в среднем 653 290 прочтений на образец). Анализы были проведены на 35% прочтений, которые не представляли загрязнения хозяина (в среднем 226 931 прочтений на образец). Более 99% прочтений принадлежат бактериям и …

Контекст 2

… Состав кишечного бактериального сообщества. Микробиота B. germanica в основном состоит из представителей типов Bacteroidetes (65%), Firmicutes (18%), Proteobacteria (15%) и Fusobacteria (1.8%) (см. рис. S1 в дополнительном материале). Три наиболее распространенных рода (Bacteroides, Dysgonomas и Parabacteroides) принадлежат к типу Bacteroidetes. Основная бактериальная микробиота, идентифицированная из контрольных образцов, состояла из 120 и 124 родов взрослых особей и нимф соответственно (см. Таблицу S1 в дополнительном материале). Нимфы …

Контекст 3

… обилие основных типов бактерий в кишечной микробиоте B. germanica было одинаковым для нимф и взрослых особей в контрольных популяциях (см.S1 и Таблицу S1 в дополнительном материале). Их бактериальное сообщество в основном состоит из Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria и Fusobacteria. Эти результаты согласуются с ранее полученными нашей группой для взрослых особей (13,49), что привело к определению основных бактериальных типов этого вида, по крайней мере, в лаборатории . ..

Контекст 4

… дизайн . Синхронизированная взрослая популяция, состоящая из особей, собранных между 0 и 48 часами после шелушения (считающихся взрослыми в нулевое время), начала первое поколение (G1) (см.1 для схемы плана эксперимента и сводки всех проанализированных образцов). Перед любой обработкой три самки тараканов вскрывали и собирали их заднюю кишку и жировое тело (образцы C0a). Затем популяция была разделена на две сбалансированные по половому признаку взрослые субпопуляции: одна, состоящая из 36 самцов и 36 самок, не была …

Streptomyces blattellae, новый актиномицет, выделенный in vivo из Blattella germanica Garza HF, Canales-Del CR, Eguiarte LE, Souza V, De TS (2017) Высокое разнообразие и предполагаемая эндемичность культивируемых

актинобактерий в чрезвычайно олиготрофном пустынном оазисе.Peer J 5:e3247

Артикул Google Scholar

Аух А.Ф., фон Ян М., Кленк Х. П., Гокер М. (2010)Цифровая ДНК-ДНК-гибридизация для разграничения микробных видов посредством сравнения последовательностей генома с геномом. Стенд Genomic Sci 2:117–134

Статья Google Scholar

Balasubramanian S, Othman EM, Kampik D, Stopper H, Hentschel U, Ziebuhr W, Oelschlaeger TA, Abdelmohsen UR (2017) Морские губки Streptomyces sp.Экстракт SBT343 ингибирует образование стафилококковой биопленки. Front Microbiol 8:236

Артикул Google Scholar

Барка Э.А., Ватса П., Санчес Л., Гаво-Вайан Н., Везель ГПВ (2015)Таксономия, физиология и натуральные продукты актинобактерий . Microbiol Mol Biol R 80:1–43

Артикул Google Scholar

Блин К., Медема М.Х., Каземпур Д., Фишбах М.А., Брейтлинг Р., Такано Э., Вебер Т. (2013) антиSMASH 2.0 — универсальная платформа для анализа геномов продуцентов вторичных метаболитов. Nucl Acids Res 41:W204–W212

Артикул Google Scholar

Chun J, Goodfellow M (1995) Филогенетический анализ рода Nocardia с последовательностями генов 16S рРНК. Int J Syst Bacteriol 45:240–245

CAS Статья Google Scholar

Collins MD (1985) Анализ изопреноидхинона в классификации и идентификации бактерий.В кн.: Гудфеллоу М., Минникин Д.Е. (ред.) Химические методы в систематике бактерий. Academic, Лондон, стр. 267–284

Google Scholar

Eguchi T, Takada N, Nakamura S, Tanaka T, Makino T, Oshima Y (1993) Streptomyces bungoensis sp. ноябрь Int J Syst Bacteriol 43:794–798

Статья Google Scholar

Felsenstein J (1981) Эволюционные деревья из последовательностей ДНК: метод максимального правдоподобия.J Mol Evol 17: 368–376

CAS Статья Google Scholar

Felsenstein J (1985) Доверительные пределы филогении: подход с использованием начальной загрузки. Эволюция 39:783–791

Статья Google Scholar

Genilloud O (2017) Актиномицеты: все еще источник новых антибиотиков. Nat Prod Rep 34:1203–1232

CAS Статья Google Scholar

Groth I, Schumann P, Rainey FA, ​​Martin K, Schuetze B, Augsten K (1997) Demetria terragena gen.ноябрь сп. nov., новый род актиномицетов, выделенных из компостной почвы. Int J Syst Bacteriol 47:1129–1133

CAS Статья Google Scholar

Guo Y, Zheng W, Rong X, Huang Y (2008) Мультилокусная филогения клады генов Streptomyces griseus 16S рРНК: использование многолокусного анализа последовательности для систематики стрептомицетов. Int J Syst Evol Microbiol 58:149–159

CAS Статья Google Scholar

Hasegawa T, Takizawa M, Tanida S (1983) Экспресс-анализ химической группировки аэробных актиномицетов. J Gen Appl Microbiol 29:319–322

CAS Статья Google Scholar

Hatano K, Nishii T, Kasai H (2003) Таксономическая переоценка мутовкообразующих видов Streptomyces (ранее Streptoverticillium ) с использованием фенотипов, ДНК-ДНК гибридизации и последовательностей 1 2r 90 предложение Streptomyces luteireticuli (ex Katoh and Arai 1957) corrig., sp. ноябрь ном. обр. Int J Syst Evol Microbiol 53:1519–1529

CAS Статья Google Scholar

Келли К.Л. (1964) Межобщественный совет по цвету: таблицы названий цветов Национального бюро стандартов, иллюстрированные центроидными цветами.Типография правительства США, Вашингтон

Google Scholar

Kim OS, Cho YJ, Lee K, Yoon SH, Kim M, Na H, Park SC, Jeon YS, Lee JH, Yi H, Won S, Chun J (2012) Представляем EzTaxon-e: прокариотический 16S База данных последовательностей генов рРНК с филотипами, которые представляют некультивируемые виды. Int J Syst Evol Microbiol 62:716–721

CAS Статья Google Scholar

Kim M, Oh HS, Park SC, Chun J (2014) На пути к таксономической согласованности между средней идентичностью нуклеотидов и сходством последовательностей генов 16S рРНК для демаркации видов прокариот.Int J Syst Evol Microbiol 64:346–351

Klykleung N, Phongsopitanun W, Pittayakhajonwut P, ​​Okuma M, Kudo T, Tanasupawat S (2016) Streptomyces phyllanthi sp. ноябрь выделен из стебля Phyllanthus amarus . Int J Syst Evol Microbiol 66:3923–3928

CAS Статья Google Scholar

Кумар С., Стечер Г., Тамура К. (2016) MEGA7: молекулярно-эволюционный генетический анализ, версия 7.0 для больших наборов данных. Мол Биол Эвол 33:1870–1874

CAS Статья Google Scholar

Lee I, Kim YO, Park SC, Chun J (2015) Orthoani: улучшенный алгоритм и программное обеспечение для расчета средней идентичности нуклеотидов. Int J Syst Evol Microbiol 66:1100–1103

Статья Google Scholar

Liang D, Wang Y (2019) Первый синтез 7-пренилизатина.Менделеевская коммуна, 29(2):172–173

CAS Статья Google Scholar

Liu C, Yao L, Lan Y, Zhao J, Piao C, Li Z et al (2017) Actinocorallia lasiicapitis sp. Nov., новый актиномицет, выделенный из головы муравья (Lasius fuliginosus L). Int J Syst Evol Microbiol 66(6):2172

Артикул Google Scholar

Meier-Kolthoff JP, Göker M (2019) TYGS — это автоматизированная высокопроизводительная платформа для современной таксономии на основе генома.Нац Коммуна 10:2182

Статья Google Scholar

Мейер-Колтхофф П.Дж., Александр Ф.А., Кленк Х.П., Гёкер М. (2013) Разграничение видов на основе последовательности генома с доверительными интервалами и улучшенными функциями расстояния. BMC Bioinformatic 14(1):60–60

Статья Google Scholar

Минникин Д.Е., О’Доннелл А.Г., Гудфеллоу М., Алдерсон Г., Атали М., Шаал К., Парлетт Д.Х. (1984) Комплексная процедура экстракции бактериальных изопреноидных хининов и полярных липидов.J Microbiol Methods 2:233–241

Prosser BLT, Palleroni NJ (1976) Streptomyces longwoodensis sp. ноябрь Int J Syst Bacteriol 26:319–322

Статья Google Scholar

Rong X, Huang Y (2012) Таксономическая оценка клады Streptomyces hygroscopicus с использованием многолокусного анализа последовательностей и ДНК-ДНК-гибридизации, подтверждение схемы MLSA для систематики всего род. Syst Appl Microbiol 35:7–18

Ржецкий А., Ней М. (1993) Теоретическая основа метода минимальной эволюции филогенетического вывода.Мол Биол Эвол 10:1073–1095

CAS пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

Saitou N, Nei M (1987) Метод соединения соседей: новый метод реконструкции филогенетических деревьев. Мол Биол Эвол 4(4):406–425

CAS пабмед ПабМед Центральный Google Scholar

Sasser M (1990) Идентификация бактерий с помощью газовой хроматографии клеточных жирных кислот, техническое примечание MIDI 101.MIDI Inc, Ньюарк

Google Scholar

Ширлинг Э.Б., Готлиб Д. (1966) Методы характеристики видов Streptomyces . Int J Syst Bacteriol 16:313–340

Статья Google Scholar

Staneck JL, Roberts GD (1974) Упрощенный подход к идентификации аэробных актиномицетов с помощью тонкослойной хроматографии. Appl Microbiol 28:226–231

CAS Статья Google Scholar

Waksman SA (1961) Actinomycetes Vol II Классификация, идентификация и описание родов и видов.Уильямс и Уилкинс, Балтимор

Google Scholar

Waksman SA, Henrici AT (1943) Номенклатура и классификация актиномицетов. J Sacteriol 66:337–341

Wiese J, Jiang Y, Tang SK, Thiel V, Schmaljohann R, Xu LH, Jiang CL, Imhoff JF (2008) Новый член семейства Micromonosporaceae, Planosporangium flavigriseum gen . ноябрь сп. ноябрь Int J Syst Evol Microbiol 58:1324–1331

CAS Статья Google Scholar

Zhang R, Han X, Xia Z, Luo X, Wan C, Zhang L (2017) Streptomyces luozhongensis sp.nov., новый актиномицет с противогрибковой и антибактериальной активностью. Антони Ван Левенгук 110: 195–203

CAS Статья Google Scholar

Zhu HH, Guo J, Yao Q, Yang SZ, Deng MR, Li TH (2011) Streptomyces caeruleatus sp. ноябрь с темно-синим диффундирующим пигментом. Int J Syst Evol Microbiol 61:507–511

CAS Статья Google Scholar

UniProt: a0a2p8zdm6_blage

ID A0A2P8ZDM6_BLAGE Не проверено; 653 АА. АС A0A2P8ZDM6;
ДТ 23-МАЙ-2018, интегрировано в УниПротКБ/ТрЭМБЛ.
ДТ 23-МАЙ-2018, вариант последовательности 1.
ДТ 29-СЕНТЯБРЬ-2021 в редакции 11.
DE SubName: Full = белок 1 захвата и подвижности клеток {ECO:0000313|EMBL:PSN54595.1};
GN Name=ELMO1 {ECO:0000313|EMBL:PSN54595.1};
GN ORFNames=C0J52_07374 {ECO:0000313|EMBL:PSN54595.1};
OS Blattella germanica (немецкий таракан) (Blatta germanica).
ОС Эукариоты; метазоа; Экдизозоа; Членистоногие; Шестиногий; насекомое; Птеригота;
ОС неоптера; многокрылые; диктиоптеры; Блаттодея; блабероидея; Эктобииды;
OC Blattellinae; Блаттелла.OX NCBI_TaxID=6973 {ECO:0000313|EMBL:PSN54595.1, ECO:0000313|Протеомы:UP000245037};
RN [1] {ECO:0000313|EMBL:PSN54595.1, ECO:0000313|Протеомы:UP000245037}
RP НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ [КРУПНОМАСШТАБНАЯ ГЕНОМНАЯ ДНК].
RC STRAIN = американский цианамид \ Orlando Normal
RC {ECO:0000313|Протеомы:UP000245037};
RC TISSUE=Все тело {ECO:0000313|EMBL:PSN54595.1};
RX PubMed = 29403074; DOI=10.1038/s41559-017-0459-1;
Р.А. Харрисон М. К., Йонгепьер Э., Робертсон Х.М., Арнинг Н., Битард-Фейлдел Т.,
Р.А. Чао Х., Чайлдерс С.П., Дин Х., Доддапанени Х., Дуган С., Говин Дж.,
Р.А. Грейнер С., Хан Ю., Ху Х., Хьюз Д.С.Т., Хюйлманс А.К., Кемена С.,
Р.А. Кремер Л.П.М., Ли С.Л., Лопес-Эскерра А., Маллет Л., Монрой-Кун Дж.М.,
Р.А. Мозер А., Мурали С.С., Музный Д.М., Отани С., Пиулахс М.Д., Пельчау М.,
Р.А. Ку Дж., Шауб Ф., Вада-Кацумата А., Уорли К.С., Се К., Илла Г.,
Р.А. Поульсен М., Гиббс Р.А., Шал С., Ричардс С., Беллес Х., Корб Дж.,
Р.А. Борнберг-Бауэр Э.;
RT «Полуметаболические геномы раскрывают молекулярную основу эусоциальности термитов.";
РЛ нац. Экол. Эвол. 2:557-566 (2018).
CC -!- ПОДКЛЕТОЧНОЕ РАСПОЛОЖЕНИЕ: Цитоплазма {ECO:0000256|ARBA:ARBA00004496}.
CC -!- ВНИМАНИЕ! Показанная здесь последовательность получена из EMBL/GenBank/DDBJ.
Полногеномный дробовик CC (WGS), который является предварительными данными.
CC {ECO:0000313|EMBL:PSN54595.1}.
СС -------------------------------------------------- --------------------------
CC Защищено авторским правом консорциума UniProt, см.  https://www.uniprot.org/terms
CC Распространяется под Creative Commons Attribution (CC BY 4.0) Лицензия
СС -------------------------------------------------- --------------------------
ДР ЭМБЛ; ПИГН01000088; ПСН54595.1; -; Геномная_ДНК.
DR протеомы; УП000245037; Несобранная последовательность WGS.
ДР ГО; GO:0005737; С: цитоплазма; МЭА: ЮниПротКБ-КВ.
ДР ГО; ГО:0030036; P: организация актинового цитоскелета; МЭА: ИнтерПро.
ДР ГО; GO:0016477; P: миграция клеток; МЭА: ИнтерПро.
ДР ГО; ГО:0006909; Р: фагоцитоз; МЭА: ИнтерПро.
ДР Gene3D; 1.25.10.10; -; 1.
ДР Gene3D; 2.30.29.30; -; 1.
ДР ИнтерПро; ИПР011989; ARM-подобный.ДР ИнтерПро; ИП016024; ARM-type_fold.
ДР ИнтерПро; ИПР024574; ДУФ3361.
ДР ИнтерПро; ИП030715; ЭЛМО1.
ДР ИнтерПро; права интеллектуальной собственности006816; ЭЛМО_дом.
ДР ИнтерПро; ИПР011993; PH-like_dom_sf.
ДР ИнтерПро; ИП001849; PH_домен.
ДР ПАНТЕРА; PTHR12771:SF23; PTHR12771:SF23; 3.
ДР Пфам; ПФ11841; ДУФ3361; 1.
ДР Пфам; ПФ04727; ЭЛМО_ЦЭД12; 1.
ДР Пфам; ПФ16457; РН_12; 1. 
ДР СУПФАМ; SSF48371; SSF48371; 1.
ДР ПРОСАЙТ; ПС51335; ЭЛМО; 1.
PE 4: Прогноз;
KW Апоптоз {ECO:0000256|ARBA:ARBA00022703};
KW Цитоплазма {ECO:0000256|ARBA:ARBA00022490};
KW Фагоцитоз {ECO:0000256|ARBA:ARBA00022907};
KW Эталонный протеом {ECO:0000313|Протеомы:UP000245037};
KW Sh4-привязка {ECO:0000256|ARBA:ARBA00023036}.ДОМЕН FT 321..502
FT/note="ЭЛМО"
FT /evidence="ECO:0000259|ПРОСАЙТ:PS51335"
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SQ 653 АА; 74075 МВт; AC7EA760581DC452 CRC64;
     MNTKVFKMPA MKDANIVKIA VEMVAQVPQL IEFNQKQPLA AIIQELCNGW GLSEPDQYAL
     QFSESNNENY ITEKNRNEIK NGSVLKLTQS PSTTAHDILQ KLNNGTGDDK LPALTKLSKL
     STDMTFALEF INKQGLALII SHIEGGKCKP GNTLAYSLIS FVELMDHGIV SWDILESPFI
     NKVASYVNNQ AVTQDAKVVQ ASLSILENIV LNSSGKYGQV EKEVTFPNLV NHLQSQNPVI
     QQNAIALINA LFLKADIAKR KAIAATLSSK LVRNVILTNI IQSSSGQVGT EMAYQLYVLQ
     TLTLGLLEQR MNLKMDPQDQ DAHDKIKELR RIAFDTDGTG LITDVTARKQ LGVFAKDYKK
     ЛГФКИДИНПА ЛДФТЭППГМ ЛАЛДЦМВЙФА РНХТЕСЫТКВ ВЛЕНСКРАДЕ ХЭКПФГРЦВ
     ELVKLLCEVL RIGEPPNEQG QNYHPMFFTH DHPFEEFFCI CIILLQVLTY SEITNLWQQE
     RTNREEWESH ARPIVELKEA ITPEIMELIQ MQRLNFMIEG TRFTKYSVRG QRIKDKFWYV
     РЛСПНХКВФХ ЙГДЦДЕКСВП ТЛЕЭЛПНКЛА ВВДИКАЛВВГ КЭЦПХМКДВС РДЭКРРККЛТР
     NKMLSKETEN DLETLLSMDI KLRMLDAEGV DIPQDPPPIP ADPPNYDFCY ELK
//
 

.

No related posts.